请教流式抗体的制备，谢谢！！

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    先介绍一下我的实验，我养的是兔的骨髓间充质干细胞，现在培养到第三代，准备做流式鉴定一下细胞，鉴定的细胞表面抗原是cd44，，打算用的抗体是抗兔的cd44，一抗是鼠抗兔的cd44抗体，二抗是FITC标记的羊抗鼠的抗体，现在遇到的困难是1：我的样本该怎么制备，就是一抗，二抗怎么滴加，也就是制备的程序?2:在做流式细胞之前，我制备的当天就可以做流式，做流式之前该怎么准备几管细胞悬液，就是阳性组和阴性组怎么准备，我不做同型对照。最近试验忙的焦头烂额的，比较着急，谢谢大家了！

leisong12

FACS Analysis
  C% ?# v; @# W( A7 s; [  C- S4 P1.        1.     Harvest cell using 0.25% trypsin  2 m3 f  H& O' Y6 h: k
2.        2.     Resuspend in 1ml DMEM/F-12 media with Trypsin inhibitor  细胞浓度为1000000个/ml# C+ z: ^: @+ ?9 Q7 j
3.        3.     Placed in a 1.5 ml micro centrifuge tube and spin down  
5 p& G" y1 M: p' p8 w+ @: f" r4.        4.     Wash with FACS buffer (1XPBS, 5% FBS, and 0.1% sodium azide) in ice / y7 N" c2 l( W
5.        5.     Resuspend in 50-100 μl and incubate in ice or 4℃ for 30 min ~ 1 hour with appropriate antibody (1:20-1:40 dilution)
0 t5 F( Z8 u! e, @5 K) d6.        6.     Wash three times with FACS buffer 个人经验是洗一篇，洗多了丢细胞& u/ w) t  f; \5 ]$ C' d; H* T6 T- j
7.        7.     Incubate with a flourescein-conjugated IgG secondary antibody(1:100) for 30 min.
9 j6 `1 q9 a  A8.        8.     Wash three times with FACS buffer 还是洗一遍  洗完加上FACS buffer 就可马上上机了' F  k* y: q$ O9 D! |& c: O. E
9.        9.     Add 0.5 ~ 1 ml of cold 1% Paraformaldehyde solution to the pellet.  这步是为了万一不能马上上机，长期保存用的，建议还是马上上的好
. O" E& u1 ^* T' r( m1 \$ v9 H10.        10. �Suspense cell immediately
! `# B  e2 i3 v7 i$ r + A+ g5 m* z9 R" k
11.        11. �Store the fixed cells at 4℃ in the dark , T# @. q' T; A, f6 m
12.        12. �These cells may be stored for at least one week prior to FACS analysis  + v( N& ^* w' e  N9 _! K7 ]" x+ L4 j
IMPORTANT: Protect from direct light
/ O- K% Y% n5 E+ M7 l+ W' \FACS Buffer Preparation
- _' t, r* K( l+ q$ N5 a9 B0 D 5mL 10% BSA (0.1% BSA)
. E# a- j! z6 _, I& L1mL 10% Azide
( E: C. p" p0 a; |4 rSome people add 2-4-5 mL EDTA Antichelating agent (prevents clumping)7 s" I7 K! \/ j5 `, B9 R
Make up to 500mL with 1x PBS
4 G! b; W$ t* b2 v" w0 {. ?

leisong12

准备一份不加任何抗体的细胞作为阴性就可以了，阳性对照没必要

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! f" J$ [* r% H6 u/ D
; s) u  K( t- W, x非常感谢！