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回复 pla269 的帖子
7 j! _% B( Z: ~ S" q. Z: N. G- I1 F" f) V8 L
请问你指的是什么细胞?另外,你要做什么样的实验,这些应该再交代清楚些啊。; H- B$ j' {/ i) H
在建立一个新的ES细胞系或者其他什么细胞系(外源基因过表达或者敲出/低)的时候是很忌讳将细胞克隆全部消化,因为这样的话阳性细胞、阴性细胞就全都混到一块去了。
1 K1 ?0 R, p/ D* S8 Z% Y建议你看下小鼠胚胎操作,上面有详细的挑克隆的步骤。
6 C! X* b- p* S, C% L Q- h一般是:
7 r ^1 k( E7 U8 N( r- C1、将旧的培养液吸掉,向培养皿中加入适量的PBS(防止挑克隆是细胞干涸)。* ]* {: y8 |/ L( K8 M# A
2、准备适当体积适当浓度的胰酶(我一般是用50ul 0.25%的TE),37度预热。
6 K0 ~% H9 N. Z4 A {# B3、在显微镜或者体视镜下,用200ul的移液器(带枪头)对准要挑取的克隆(若是ES克隆的话,先将该克隆周围的feeder划开),一抽吸,克隆就被吸到tips里了。
) T9 t; n8 G, t0 }4、将该克隆转移到预热好的TE里消化(若是ES克隆的话,消化<5min,都OK)。
9 s+ S0 ]/ [+ z/ I0 W _5、相同体积的培养液中和,然后铺到相应的孔板中(ES克隆,我们铺到24孔板的一个孔,完全没问题)。 |
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