细胞怎么挑单克隆啊

pla269

大家好，哪位大侠指教一下细胞怎么挑单克隆啊

seall

最好选一个培养孔里有一个克隆的消化传代，如果没有可以在显微镜下用枪头或者是无菌的东西把单克隆刮下来，再放在孔板培养，应该可以！
3 |. I. R. Y8 C9 }" N! [
/ p0 Q  D6 |/ m' G. I0 t" u- M

zzc2211

我的办法：养的是肿瘤细胞，细胞汇合度80%，状态好（状态不好铺种后死亡太多），消化后充分吹打混匀，离心，加入适量培养液，再充分混匀（目的保证细胞为单个的，从而长成单细胞克隆），计数100，200，400个细胞，分别入3个10cmdish。充分吹打混匀。37℃孵箱培养，不同细胞需要不同的生长时间，中间可能需要换一次培养液。每天注意观察，待细胞克隆长到40~50个细胞以上，考虑终止。显微镜下观察想要挑的克隆，并在dish底部做记号。相邻太近的克隆不能选。一个dish选5~10个即可（操作快多选）。弃培养液，PBS清洗，吸取2.5ul胰酶原液（0.25%）逐一打到标记的记号上，37℃静置约20秒。观察消化好了没有，不需彻底消化。吸取5ul培养液终止消化，并轻轻吹吸，两次，把细胞吸取到已放置培养液的48孔板。逐一终止。再用大枪头把细胞混匀。注意换枪头。培养细胞。逐渐的扩增到24，12，6孔板。就OK了。过程中注意细节以保证是单细胞克隆。

echowdk

回复 pla269 的帖子
2 I' @9 E: L7 `/ H5 K
! _  K* u) Y7 I; t( i6 x( x5 p请问你指的是什么细胞？另外，你要做什么样的实验，这些应该再交代清楚些啊。
7 f" `) H; y5 ^. Q+ p1 u在建立一个新的ES细胞系或者其他什么细胞系（外源基因过表达或者敲出/低)的时候是很忌讳将细胞克隆全部消化，因为这样的话阳性细胞、阴性细胞就全都混到一块去了。
* `, R$ U* \3 ]; k6 R建议你看下小鼠胚胎操作，上面有详细的挑克隆的步骤。
+ `" T  q" O% f- x$ ^一般是：
# v1 _* D4 b$ K1 `1、将旧的培养液吸掉，向培养皿中加入适量的PBS（防止挑克隆是细胞干涸）。
# G- S9 _! U% ~6 L0 \: Y! Y2、准备适当体积适当浓度的胰酶（我一般是用50ul 0.25%的TE），37度预热。
. c) H% T# u! R3、在显微镜或者体视镜下，用200ul的移液器（带枪头）对准要挑取的克隆（若是ES克隆的话，先将该克隆周围的feeder划开），一抽吸，克隆就被吸到tips里了。# L) l) Q* b) w) }
4、将该克隆转移到预热好的TE里消化（若是ES克隆的话，消化<5min，都OK）。
& z% K4 `0 f: ?& [$ O' e5、相同体积的培养液中和，然后铺到相应的孔板中（ES克隆，我们铺到24孔板的一个孔，完全没问题）。

流浪的波斯猫

根据你的实验目的所对克隆的概念是不一样的
) |/ Y  l* u0 _1 q如果实验研究  原代细胞的克隆就是细胞在生长过程中聚合在一起的细胞，这个可以通过胰酶消化或者机械的方法来挑选单克隆
% w1 s- j7 V. B如果是胚胎干细胞系 一般是通过胶原酶和机械消化法联合的运用3 l' l5 Q& R/ T# r8 D  d
如果是工业化细胞生产 可以利用96孔板 进行梯度稀释