基因组编辑工具新工具：改造Cre重组酶

yinfuhua

基因组编辑工具新工具：改造Cre重组酶  F: n! e3 `" ~' \
2013-10-22 来源：ebiotrade 作者：koo
$ J  H/ u% E/ V% u- A
: [* n5 D" E& }3 YZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系统是当今十分流行的基因组编辑工具，但它们并不是唯一的选择。位点特异的重组酶也很有用。如今，哈佛大学的研究人员报告了一个重组酶的突变体（Cre），其特异性比野生型的酶要高得多，这一特点对基因治疗应用来说极具吸引力。
( i+ P! W/ ^2 {! V5 yNikolai Eroshenko 是哈佛大学工程和应用科学院的研究生。他和他的导师—著名的遗传学家 George Church —在《自然-通讯》上发表了他们的研究成果。
, B1 H% K8 D( \! D# d) ?& w, {Eroshenko 的研究方向是人类基因治疗，也就是用野生型或“正确”的副本来替换突变基因。但是，将这一副本插入基因组却并不容易。研究人员可以使用病毒，但无法控制整合位点。引入双链 DNA 断裂的核酸酶是另一种选择，但它们需要同源重组的修复，这在人类细胞中相当罕见。  o- w7 |( p9 @! i% e
Cre 等重组酶在人类细胞中非常高效，也不需要内源的 DNA 修复。为了使用它们，研究人员必须改造重组酶结合位点（ loxP ）和待插入的 DNA ，剩下的就由酶来完成。一般来说，重组酶过程被认为相当特异。然而，一些证据也表明脱靶效应的可能性。
  k% ]) s9 E8 K9 F, B为了提高 Cre 的特异性， Eroshenko 利用数学建模来确定改善蛋白准确性而又不牺牲效率的策略。他发现，针对 Cre 形成二聚体能力（而不是与 DNA 结合）的突变有可能会成功。
# e5 Z9 {3 R3 @随后 Eroshenko 利用 PCR 突变法来改造蛋白 N 端附近的 α 螺旋，它参与了二聚化，而未参与 DNA 结合。利用双选择策略，他确定了三个突变体，它们全都保留了正确靶定 loxP 位点的能力，但又避开与 loxP 相似的假序列。他在体外以及细菌和哺乳动物细胞内将这些突变体与野生型的 Cre 重组酶进行比较，发现酶的效率稍低，但更加特异。0 b- I1 q* ]) O( Q$ A
在大肠杆菌中，Eroshenko 观察到野生酶的错误率约为 1/10,000 个细胞。“我们有些突变体要高三个数量级或以上。”
/ P2 U# |2 c5 M, e  E2 X, }Eroshenko 表示他的长期目标是重新改造重组酶，让它靶定 loxP 之外的位点，如人类基因组中已经存在的内源 pseudo- loxP 位点，这样重组酶就可以用于未经修饰的基因组。
3 d, g+ Y5 \: [, P; Z! m不过，梅约诊所的助理教授 Karl Clark 对此结果表示很惊讶。他本人也在研究基因组编辑工具，包括重组酶 Cre。“我没有听到很多人抱怨 Cre/loxP 是非选择性的，”他说。5 {* |" t6 U% w
Clark 表示，他计划在其实验室中尝试这些新的突变体，看看它们是否在斑马鱼中起作用。他指出，对于许多应用，如转基因应用，利用 Cre 来短暂激活沉默的基因，野生酶的准确性已足够。# `# |1 R+ [: m
延伸阅读：% F3 f) b8 o" G
基因组工程学里的三大利器 ——ZFN、TALEN和CRISPR/Cas
$ b* t' p9 |4 r6 J9 ^9 D3 v原文检索：/ Z. e6 ~6 O& l8 E
Nikolai Eroshenko & George M. Church. Mutants of Cre recombinase with improved accuracy. Nature Communications, 23 September 2013; doi:10.1038/ncomms3509+ E8 a0 d# c1 v1 q# V: m
期刊% H/ o% l. i6 d+ ~) h

461650833

6 {2 J" _6 J  [# {2 Y, ^  H. m. c9 b* L: F7 Q% {! ?: G
http://pan.baidu.com/share/link?... 2&uk=1143554654呵呵 我搜到的一个下载链接 大家去下吧

yinfuhua

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5 X% A7 l; K7 w$ F" w5 J9 F谢谢！

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客气了

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谢谢

细胞海洋

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2 }; L  H# A3 I: s8 T; e
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  t- x7 T6 V5 C怎么会？？我都下载了啊
2 v3 U" E" d' v+ f# M0 J" |. V% ^

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http://pan.baidu.com/s/1suWx8
; N6 h) v4 d; p# v4 h0 c这是我新弄的 大家看看好使不

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3 W# J1 o  N9 r6 E8 r- |( u
我重新弄了一个链接 可以试试好使不！