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我把我的具体试验方法附上
7 s$ D& G+ T& F5 J步骤：$ J. T- `- B+ F; j1 X* z( S
1) 30 l酶切体系样品，走0.8% 琼脂糖凝胶，恒压40V电泳过夜（12-16h）。* {+ c* b# g0 c) x
2) 溴酚蓝距离加样孔10-15cm左右时停止电泳。
8 ^- l8 v% O( i& Q1 z8 ^& L3) 切去无用的凝胶部分，将凝胶浸泡于适量变性液中，轻轻摇动1h。对于较大的DNA片断(>15kb)，可于变性前用0.2mol／L HCI预处理10min使脱嘌呤，再进行碱变性处理。6 g$ k, y2 l7 ~# |, C3 V" I
4) 将疑胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量中和液30min，轻轻摇动，重复一次。将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。
d( ?* ]( I9 t* @* l! g* H, F5) 裁剪4张同凝胶大小相同或稍大的Whatman 3MM滤纸，浸泡于1×TBE或TAE中，取2张置于一海绵上。; J6 U7 F( f5 i P2 e
6) 裁剪一张同凝胶大小相同的尼龙膜，置水中使其从底部向上浸润，然后置于1×TBE或TAE中浸泡。将充分湿润的尼龙膜覆盖于凝胶上，一端与加样孔对齐，注意排除二者间的气泡。在尼龙膜上再覆盖两张润湿的Whatman 3MM滤纸，然后盖上另一张海绵。海绵两侧夹上凝胶支持夹，置于电转仪中，注意尼龙膜一侧置于正极，凝胶一侧置于负极。（标记好膜的DNA面）
/ h( G/ s: H/ Y7 X: l, O7) 300～600mA恒流电泳，4～8h，循环水冷却。
, F& h2 w3 N$ p8 V. x4 x8) 电转完毕，尼龙膜用2×SSC漂洗，干燥滤纸吸干。9 P- r8 a2 a& h# C; a- x
DNA固定：尼龙膜可用短波紫外线照射几分钟，或者真空下80℃烘烤2h，以使DNA固定于尼龙膜上。（这里可以短时间干燥保存膜哦，2-8摄氏度）5 ?- X/ {6 T' W; Y5 j, O( H
: g. B% b7 c/ d# v( Y- r6 X/ Q+ c7 t! I) a) C/ c% ?; f
1 A/ b" a5 N6 x. d4 P. y
/ J$ P6 p7 D+ L# M
$ I+ _0 M2 w* u' k1 G5 O6 l. z: f( Z M+ Q
* U7 E& |# k/ Z+ n4 Z! w+ N3 L
1 x1 t6 T% Y2 E
* `1 P: O) @- I8 f' b3 P0 m- k7 a2. 制备地高辛标记探针（详见kitII P9）: Q0 r f3 L$ ~" L# p
试剂：
. H9 t4 u& {- k/ a# X' @" Fdouble distilled water(ddH2O)：稀释DNA
' h1 c. [7 [ C, D5 V( ?0 EEDTA(0.2M， pH8.0 )：终止标记反应4 C `+ I0 \% N b) E% F% O6 s" e# d
DIG-High Prime (kit)：瓶1，防止反复冻融（-20℃保存）; H* T4 ?, Y; b, D1 ~
! j5 h J( y% u6 b. j
目的基因探针标记(随机引物法)：20ul体系. {3 j; ?, Y! Q( T( X& U7 a
(1) 1ug (至少300ng)模板DNA，用无菌ddH2O稀释到16ul。0 ^5 G9 M4 m' p5 X" K4 c2 z
(2) 沸水浴煮10min，立即放入冰中。
. Q6 o2 x* ?3 u- S(3) 混匀DIG-High Prime （瓶1），加4ul到变性DNA中，混匀，稍加离心。+ l! {6 t" a1 v" k0 p) d( w
(4) 37 ℃反应过夜（约20小时）。
/ H7 {0 ?; ]- i; e1 F) q! K# L(5) 加入2ul 0.2M EDTA（Ph8.0）或65℃ 10min 终止反应。& L* X1 c* w: p/ k% C# B' S4 M
) r" u% w9 P- x$ a9 A3 P9 {
3. 杂交:6 A2 f# ~' z K/ y" ^
探针 使用浓度 杂交液 杂交温度% t# r/ t. P+ \! W- }5 H. w: d* M- H! w
DNA 25ng/ml 标准杂交液 68℃+ O$ ]5 B( S s6 o
标准杂交液＋50%甲酰胺 37-42℃
& n" O9 }- r" i! O/ {6 XRNA 100ng/ml 标准杂交液＋50%甲酰胺 50℃
. L1 G4 r# k0 u$ P n4 ]: B, N3 K+ F- Q" [
试剂：8 o. |0 T+ D- b# K; z0 `7 {2 W
溶液 成分/用途 配方
# g! U0 R6 J7 \6 m; e4 hDIG Easy Hyb (Kit) 杂交液 将64ml 灭菌dd H2O分两份小心加入DIG Easy Hyb Granules（瓶7），立即在37℃下搅拌约5min使其溶解。
- E$ F4 {8 l+ {/ P+ m10% SDS SDS 80ml H2O + 10g SDS→ 加热助溶→ 定容到100ml（用0.22um孔径的滤膜过滤除菌）
* `- Y$ b3 N( I% p
, P/ _. Y. N. j, h7 q8 l' k/ [! V! _步骤：
9 b% y& ^& J; v. Q5 T1）预杂交：将膜浸入预热到杂交温度的（65℃）DIG Easy Hyb中（10ml /100cm2膜），在杂交箱中65℃ ，60 rpm，预杂交至少30min（可延长到1h）。
2 o. ]: l6 W' T- P2) 将DNA探针（约25ng/ml DIG Easy Hyb）在100℃变性5 min后，立即放到冰上，冷却2 min。
$ j" C/ H# B' \# F2 \7 K1) 将变性的DNA探针加到预热的（65℃）DIG Easy Hyb中（3.5ml /100cm2膜），轻柔混匀，避免泡沫。* E( W0 R/ E6 _9 z* N1 r* e
2) 倒掉预杂交液，将杂交液倒入杂交瓶中，65℃，60 rpm，杂交12－16小时。$ J3 r* \* f& G
3) 杂交结束，回收杂交液，－20℃可保存1年，再用时68℃加热10min重新变性探针。
+ X, U. W2 A8 c+ Q! v/ F
' K, ] \" M9 O2 L& j! {7 \* }4. 洗膜：% l( }" m) U0 s) p7 T* N3 y
8 Y2 A/ C9 f2 k% P n5 m- d1）低严谨性（高盐，低温）：充足的2×SSC＋0.1% SDS，室温 60 rpm 洗涤2×5 min。
! G- T, S) W( b0 @% Y2）高严谨性（低盐，高温）：0.5×SSC＋0.1% SDS（预热到洗涤温度），60 rpm 洗涤2×15 min。
$ x$ e) @0 w% W& t+ y7 z5 I注：如果探针＞150 bp 且G/C% 较高，应当在68℃洗膜；短于100bp时，洗涤温度同杂交温度。一般都是用65℃洗膜。* ^4 o' i. M' }1 s1 i- y3 d
- [9 v! Z- q: Z1 o3 v, h9 P: E$ [. _& _
) u: e* a# Q5 S& W; J5 ]* x! v& L) {& D; t4 s: k r
& g6 T1 \+ W$ }
4 Y* X4 r8 }7 a" |- ^+ y% I! K! Q# } }/ P+ b3 }
$ h0 U3 L# C7 v, G6 G3 }- g0 \" u
7 ?; Y2 i3 D$ k7 @
5. 检测：应用化学发光检测法，所有操作都在室温进行
3 r$ w6 t4 W6 A* B溶液 成分 配方
; \. r m: p: T" Q. N/ M8 V1M马来酸 马来酸（maleic acid） 400ml H2O +58.04g maleic acid→ 定容到500ml（65℃助溶）
: V u- ]8 H* ~; X马来酸Buffer 0.1M maleic acid
, x# t$ I0 ]% F) A0.15M NaCl8 C0 a" J+ q0 x% {7 ^! [' h
pH7.5 (20℃) 1M maleic acid 100ml
, E+ _+ c8 }% X( `5M NaCl 30ml
7 K1 u9 n: R/ tH2O 870ml" u# B- A6 _8 [: V1 z
用固体NaOH调pH至7.5（要仔细，易调过）% y C; p& ]8 f% |: Q
Washing buffer 0.1M maleic acid1 O {6 H6 Q3 d# g0 _' ?3 R* o+ Y
0.15M NaCl# F; x6 C; m7 g* z: W) Y! U
0.3% (v/v) Tween 20
# r% p* l8 K1 e2 t3 n J2 wpH7.5 (20℃) 1M maleic acid 100ml8 k; `0 p- K) Q1 y) P2 d0 n
3M NaCl 50ml
9 P6 i1 d" I! hTween 20 3ml
4 @9 s. v' c; w8 G: u7 S( O5 i( TH2O 847ml
* W/ u3 _7 Q+ b( t% w% h/ p用固体NaOH调pH至7.52 `4 T, @8 M* Y g
1M Tris-Cl, pH9.5 Tris, HCl 400ml H2O + 60.5g Tris→ HCl（浓HCl约3ml左右）调pH至9.5→ 定容到500ml→ 灭菌
: K3 _0 K5 n; M* dDetection buffer 100mM Tris-Cl, pH9.5
+ P. ^+ s% x( r3 [7 M$ o5 C100mM NaCl& ~) w3 k+ |0 x' V0 O5 O: n
1M Tris-Cl, pH9.5 50ml: r3 i$ Y" T9 g4 Q9 i5 E6 \* \( G, i
5M NaCl 10ml
( R+ u9 j6 W* a- O% [H2O 415ml4 u6 ?9 B) Q, a, j
3M NaCl NaCl 400ml H2O +87.65g NaCl→ 加热助溶→ 定容到500ml→ 灭菌
! J Y1 k! F8 K( QBlocking solution（现用现配） 10×Blocking solution（Kit 瓶6） 10×Blocking solution 10ml 3 V* [" L" }/ u- Q2 Q% f
马来酸Buffer 90ml( z W. F& B0 j8 R; A
Antibody solution Anti-Digoxigenin-AP（Kit 瓶4）（75mU/ml） 1: 10000 稀释 将Anti-Digoxigenin-AP 在10000rpm离心5 min ，从表面吸取溶液。
r$ R: V! b9 z3 `2ul / 20ml Blocking solution
' V; o, [* g. f: }
5 [' @8 g, m# j步骤：
& C* d2 d# l6 U- I4 u! n1 m5 m- X3 X1）杂交结束并洗膜后，在Washing buffer中短暂冲洗膜约1-5 min。6 f; C% \( |0 H4 ~6 a! V- Q
2）在80ml Blocking solution 中封闭30 min。（轻摇）
* q; y% m1 S( F2 D/ l3）在20ml Antibody solution 中反应30 min。" Y9 {( H2 {$ J G
4) 转移膜入新容器，用Washing buffer 洗两次，每次15min。9 l3 @( k; P5 {$ I5 u, H. s6 h
5）在20ml Detection buffer 中平衡2-5min。
8 R3 ?5 v/ L, `6）将膜DNA面朝上小心放入杂交袋中，吸取1ml CSPD ready-to-use（Kit瓶5）均匀应用到膜上，立即将杂交袋的上层盖在膜上，使底物均匀布满膜表面，并且避免气泡产生。0 H0 n2 L# W: x% l, _# z3 C
室温反应5min 。
* C( a# r, G+ P7）挤出多余液体，将杂交袋的边缘封住。（防止膜干燥）, y+ N" L% n l0 F( B) D
8）将膜放在37℃ ，10 min ，以强化发光反应。: Y' g/ {9 I0 p1 e6 D
9）曝光X-胶片15-25min，观察结果。
; G$ |: x1 X3 ]8 K, m8 L; \5 w |
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发表于 2012-2-9 08:41
发表于 2012-2-9 10:18
