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我把我的具体试验方法附上2 O! p% r* G& p# I6 A5 o% N" v
步骤：' _1 _" t: ] a" f, q2 W; V
1) 30 l酶切体系样品，走0.8% 琼脂糖凝胶，恒压40V电泳过夜（12-16h）。
! F5 V3 l9 _/ B; i: x% J3 W2) 溴酚蓝距离加样孔10-15cm左右时停止电泳。
! w0 I8 W- M2 F y4 ^3) 切去无用的凝胶部分，将凝胶浸泡于适量变性液中，轻轻摇动1h。对于较大的DNA片断(>15kb)，可于变性前用0.2mol／L HCI预处理10min使脱嘌呤，再进行碱变性处理。
( J0 h( e8 T6 L- I8 _4) 将疑胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量中和液30min，轻轻摇动，重复一次。将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。+ Y& ^1 I3 l% Z* `) \7 E
5) 裁剪4张同凝胶大小相同或稍大的Whatman 3MM滤纸，浸泡于1×TBE或TAE中，取2张置于一海绵上。5 }' e3 Q: d& f( l
6) 裁剪一张同凝胶大小相同的尼龙膜，置水中使其从底部向上浸润，然后置于1×TBE或TAE中浸泡。将充分湿润的尼龙膜覆盖于凝胶上，一端与加样孔对齐，注意排除二者间的气泡。在尼龙膜上再覆盖两张润湿的Whatman 3MM滤纸，然后盖上另一张海绵。海绵两侧夹上凝胶支持夹，置于电转仪中，注意尼龙膜一侧置于正极，凝胶一侧置于负极。（标记好膜的DNA面）
. A5 U, w! [ h, [' m: x# p$ s* b7) 300～600mA恒流电泳，4～8h，循环水冷却。
9 w$ g$ f! g, |6 f: e2 e8) 电转完毕，尼龙膜用2×SSC漂洗，干燥滤纸吸干。
" b( x5 Q7 Y1 A; ~. E7 `& BDNA固定：尼龙膜可用短波紫外线照射几分钟，或者真空下80℃烘烤2h，以使DNA固定于尼龙膜上。（这里可以短时间干燥保存膜哦，2-8摄氏度） ^3 g% ]% `( h' J! d1 j: K
. ^$ X/ X% n% J1 e0 D Y7 u! |
3 L; {, ?* n$ Z f
% m6 r& l7 P$ U0 A8 \6 h( X* u# z4 a; X0 |4 g- a, {
0 Q; L* r4 Z$ ]& l" Z q. M
2 g2 _+ ^, n) x9 C" k8 H8 r, A% z
: ?3 j' q9 ^( ?! L( A( H9 V1 P& w5 _: d
2. 制备地高辛标记探针（详见kitII P9）
. W7 U/ E8 Y2 p3 C( B. E% Q试剂：
, W; U6 s* { S$ v, G2 {double distilled water(ddH2O)：稀释DNA
- l# ~( `' u# nEDTA(0.2M， pH8.0 )：终止标记反应: R* I) c& U! D2 g$ J3 b
DIG-High Prime (kit)：瓶1，防止反复冻融（-20℃保存）/ f, M2 ?# b4 B& m! X* \
+ Q [- T1 p1 P0 f3 @' } p
目的基因探针标记(随机引物法)：20ul体系! d/ l. @1 {$ X% D1 C/ b" v" A
(1) 1ug (至少300ng)模板DNA，用无菌ddH2O稀释到16ul。
9 y' Z/ ]4 N& s; i' E% J9 N# w(2) 沸水浴煮10min，立即放入冰中。
0 v' v2 G$ s+ Y2 {; ?(3) 混匀DIG-High Prime （瓶1），加4ul到变性DNA中，混匀，稍加离心。
" Y: v* g5 e4 q$ C" l7 P J9 m(4) 37 ℃反应过夜（约20小时）。
, m. U6 A4 h$ e0 Y# K4 n/ D/ [6 S(5) 加入2ul 0.2M EDTA（Ph8.0）或65℃ 10min 终止反应。
6 G0 k) G7 y3 ~: K. k H
0 Z! r" J8 `( a9 G( }6 {# ?3. 杂交:
; V4 c% L3 b, q4 Z2 L探针 使用浓度 杂交液 杂交温度
3 D1 b* H8 D" o; d1 _) mDNA 25ng/ml 标准杂交液 68℃
, w. k! D" N+ E# @( @ 标准杂交液＋50%甲酰胺 37-42℃
+ x" a; q+ R' n" G, N8 @- vRNA 100ng/ml 标准杂交液＋50%甲酰胺 50℃' ~- }# B& D# b7 `8 k |( d: q6 d
' @) n0 O+ h! u: ~
试剂：
3 t" X4 j/ N( R+ n9 W$ _溶液 成分/用途 配方- N% v/ k1 y( P3 ~1 w, Y a: h
DIG Easy Hyb (Kit) 杂交液 将64ml 灭菌dd H2O分两份小心加入DIG Easy Hyb Granules（瓶7），立即在37℃下搅拌约5min使其溶解。1 y& b' c, D# ^' _$ S- o {
10% SDS SDS 80ml H2O + 10g SDS→ 加热助溶→ 定容到100ml（用0.22um孔径的滤膜过滤除菌）
9 C) j8 Y+ b$ _6 }
; W# K% s1 J+ O步骤：/ \! T! K; k. s/ ~( m
1）预杂交：将膜浸入预热到杂交温度的（65℃）DIG Easy Hyb中（10ml /100cm2膜），在杂交箱中65℃ ，60 rpm，预杂交至少30min（可延长到1h）。
/ t J. |9 h- B9 `) C4 q2) 将DNA探针（约25ng/ml DIG Easy Hyb）在100℃变性5 min后，立即放到冰上，冷却2 min。
7 e5 _. n9 V7 x* E1) 将变性的DNA探针加到预热的（65℃）DIG Easy Hyb中（3.5ml /100cm2膜），轻柔混匀，避免泡沫。0 l" _/ j0 u) x& ?7 {
2) 倒掉预杂交液，将杂交液倒入杂交瓶中，65℃，60 rpm，杂交12－16小时。6 \1 }; Q" j; w& m; B l) X
3) 杂交结束，回收杂交液，－20℃可保存1年，再用时68℃加热10min重新变性探针。 4 |: _0 w: {1 X9 M
+ p0 K# l$ p$ l( g3 |- H, N$ |. ^4. 洗膜：" }. r+ R# N! k; \1 N9 u
/ x& S: T: V1 E1 O/ l( k; p1）低严谨性（高盐，低温）：充足的2×SSC＋0.1% SDS，室温 60 rpm 洗涤2×5 min。% F( v" H, B" e( b4 O: V
2）高严谨性（低盐，高温）：0.5×SSC＋0.1% SDS（预热到洗涤温度），60 rpm 洗涤2×15 min。- d1 E2 Y: ?; `
注：如果探针＞150 bp 且G/C% 较高，应当在68℃洗膜；短于100bp时，洗涤温度同杂交温度。一般都是用65℃洗膜。& ~- W/ E" w# j, M$ m, D
2 {+ ?' K5 k3 r' F$ }- U; v2 d7 t/ J, k& @
, C- b$ M' ?$ P
! ]# B! C2 V5 D7 x$ C! a; Z9 c& S% \7 z8 Y
& F# x3 B/ C8 L. P2 s% `/ C. X& j1 h5 e5 M! h
# I o" i; ~2 B5. 检测：应用化学发光检测法，所有操作都在室温进行
# h- n: `0 M; }! Z. n溶液 成分 配方
& f# h# n* a% l8 |; d' W8 a; u1M马来酸 马来酸（maleic acid） 400ml H2O +58.04g maleic acid→ 定容到500ml（65℃助溶）
" k; q, M/ T/ {7 r4 J马来酸Buffer 0.1M maleic acid
5 i3 ^# P& |: Y: E/ }0.15M NaCl
! S8 J+ r0 m, M" e( M9 t& \pH7.5 (20℃) 1M maleic acid 100ml$ |' |$ d) \* r- G! V2 u+ v
5M NaCl 30ml
. \ C+ l- ]( K" o* h. L- Y, eH2O 870ml6 Q4 T9 e2 g5 q; X& ?
用固体NaOH调pH至7.5（要仔细，易调过）, W) N! S1 \0 l2 D
Washing buffer 0.1M maleic acid
7 w4 @/ p, ?# b7 F0.15M NaCl4 d' t g9 Q" }
0.3% (v/v) Tween 20" u$ i+ k/ D5 Z; c0 g3 p
pH7.5 (20℃) 1M maleic acid 100ml6 M8 |* G$ {: h7 E, W7 {3 U% q
3M NaCl 50ml ' G& U: B3 J6 H+ ~* d- D
Tween 20 3ml2 r) c: X& V, W/ X* P1 F2 M
H2O 847ml8 z" ~$ v5 |' z/ N: d
用固体NaOH调pH至7.5; f" j. C8 t; s5 B8 Y+ D
1M Tris-Cl, pH9.5 Tris, HCl 400ml H2O + 60.5g Tris→ HCl（浓HCl约3ml左右）调pH至9.5→ 定容到500ml→ 灭菌
4 h( j) `. r r' K3 Z7 rDetection buffer 100mM Tris-Cl, pH9.5
6 D1 H' F9 e4 G I! m! S4 t5 x2 Y100mM NaCl! [( x0 g: H8 i+ B! H) K
1M Tris-Cl, pH9.5 50ml
/ b) T# N2 ?9 {1 X& P1 _5M NaCl 10ml
/ E7 O" M8 r' B$ S7 |7 E4 I3 {H2O 415ml. L4 `$ x$ {2 {2 N. \4 L
3M NaCl NaCl 400ml H2O +87.65g NaCl→ 加热助溶→ 定容到500ml→ 灭菌
5 ~, G/ a! i6 e. yBlocking solution（现用现配） 10×Blocking solution（Kit 瓶6） 10×Blocking solution 10ml
( Y3 |' v; F+ p马来酸Buffer 90ml/ X5 ~) w" L% m: j9 C. H w5 J
Antibody solution Anti-Digoxigenin-AP（Kit 瓶4）（75mU/ml） 1: 10000 稀释 将Anti-Digoxigenin-AP 在10000rpm离心5 min ，从表面吸取溶液。
) @) K* y4 ?4 k& L" q7 M! v/ S0 F2ul / 20ml Blocking solution, l+ D; p% B) }1 E2 G! z2 G
9 B: d$ M8 u. `; P h
步骤：7 l* B3 g( K2 `+ @1 X/ L( v9 B7 D
1）杂交结束并洗膜后，在Washing buffer中短暂冲洗膜约1-5 min。7 Q* q, } i( o, [' A: e
2）在80ml Blocking solution 中封闭30 min。（轻摇）
2 j0 b. A1 c8 O5 U" Q( p3）在20ml Antibody solution 中反应30 min。( H" m7 a7 ]& |& n7 e+ L6 u/ a+ E
4) 转移膜入新容器，用Washing buffer 洗两次，每次15min。( M: g/ u e3 P0 e+ W& h+ K9 d
5）在20ml Detection buffer 中平衡2-5min。
1 X" E" o7 h+ i1 w3 {6）将膜DNA面朝上小心放入杂交袋中，吸取1ml CSPD ready-to-use（Kit瓶5）均匀应用到膜上，立即将杂交袋的上层盖在膜上，使底物均匀布满膜表面，并且避免气泡产生。
* y, ?- l$ M$ d, K- s8 |' `$ ~ 室温反应5min 。
/ T5 q Y P' U! m7）挤出多余液体，将杂交袋的边缘封住。（防止膜干燥）0 p$ ?# x# Y5 H
8）将膜放在37℃ ，10 min ，以强化发光反应。! G7 ~6 y) d% N5 T" P2 h
9）曝光X-胶片15-25min，观察结果。' t% s! s, U8 w/ [9 ]! W4 w+ a
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发表于 2012-2-9 08:41
发表于 2012-2-9 10:18
