求一篇正儿八经的专门讲如何用lentivirus转染ES或者SSC的文献

ying

整个板块号称是研究如何转染ES，但看起来全都是讲如何包装病毒、如何做感受态之类的很基本的东西。有哪位达人手上有专门讲如何转染干细胞特别是ES或者SSC的文章？希望能包括如下一些内容：6 l& ~; D' }# s( I! \7 l8 o
1，需要的病毒滴度；
- d2 a. \8 h2 o2 D. U1 t+ C/ ?2 G3 _2，ES（或SSC）的转染的目的基因（或RNA)promoter的选取的特殊性，和各个promoter的强弱关系（CMV，EF1a,CAG,H1,U6等）和它们的适用情况；
% ]+ v5 ?3 j4 c7 K2 A: `0 `3，与基因表达后被细胞沉默相关的知识，比如说CMV转到ES之后会沉默但细胞分化后会重新开启吗？: [, e( [) I6 u' t
4，用何种protocol转染，具体程序，包括如何铺细胞，加不加MEF做feeder，加不加polybrane，转染几个小时，转后何时换液，最后何时检测阳性细胞，第一次转染一种ES的时候各种条件怎么摸（哪些条件要摸个小梯度），如何用药物筛选阳性（包括如何做药物浓度的曲线）；
& J3 L  @- ?7 h# J5，各种trouble shooting。' ~" X1 J# F/ J: ]; V; I( `
期盼各位达人的指导。我是做SSC的，需要转染lentivirus。昨天在这里也看到一位网友要做这个实验。
. f8 y: _. n( @! `我对做这一块非常没有经验，从文献和各个同学的反映来看，这一行的水也很深，鄙人觉得亚历山大～

ghfvcat

这个问题太大了，没看到有这么全的文章，你从公司买的话，倒可以仔细问问。7 f7 g7 V; Y7 N. @* W: _% }$ j
1：需要的滴度和细胞类型有关，一般给出的有效滴度都是以包装细胞如293T之类为靶细胞感染测量的，不同的靶细胞需要先测试下感染效率。以90%以上的阳性率为达标。/ A# I: b6 n! ?- S& }
2：除非有文献报道说某个启动子不能使用，一般CMV,EF1a之类都是常用的。可以通过报道基因来看一下效率。0 h; x  T. _; H9 a; ^3 f
3：不清楚，CMV被沉默好像也不是百分百的，只是表达量稍低吧？
1 E- H$ o- i" A. F6 N% E; f4：病毒进入靶细胞，不能叫转染了，应该叫感染。转染是前期包装病毒时的操作。至于feeder cell，最好在无饲养细胞的时候操作。polybrene是用来增加感染能力的，有一定细胞毒性，需要试试浓度，不加就能感染的话，就不要加了。药物筛选和普通细胞一样。
) L' I2 x2 Q; @6 h+ g. D
' e6 m  j) U6 b. y! ?

runsong

同求 帮顶

gact

ES中会感染病毒的，至于CMV沉默也有人提过，这方面的文献还没看到。。。

寒山拾得

ES中不同promoter 活性文献

chips100

前几天刚慢病毒做了个干扰，CMV驱动荧光，荧光有强有弱，选强的就行了，荧光看起来也挺好。
; C9 i# ?' j) D3 q1，需要的病毒滴度；; L" Z# u# g# I0 r
---------------直接病毒液转，不测滴度- U# E5 r- n( U0 o- ~$ s
2.和各个promoter的强弱关系（CMV，EF1a,CAG,H1,U6等）和它们的适用情况；
% {7 `  N7 n4 S----------个人以为绝对的强弱可能并不明显，可能跟插入位置有关，当然有人说EF1比较强。" t0 p- u9 P+ ^8 r5 o4 c
3.与基因表达后被细胞沉默相关的知识，比如说CMV转到ES之后会沉默但细胞分化后会重新开启吗？) ; i# g% x) V3 Q) S) m, d( j
----------沉默为什么会影响分化呢- M4 z! l% r0 v% T
4，用何种protocol转染，具体程序，包括如何铺细胞，加不加MEF做feeder，加不加polybrane，转染几个小时，转后何时换液，最后何时检测阳性细胞，第一次转染一种ES的时候各种条件怎么摸（哪些条件要摸个小梯度），如何用药物筛选阳性（包括如何做药物浓度的曲线）
. Q& j: ?) Q  i% l) R" c------------------加mef，不加polybrene，当然推荐加8 Y  m* r' [0 {- E, X. U
5 各种trouble shooting。6 o7 n9 d% c9 i+ d
------------------没什么trouble