求一篇正儿八经的专门讲如何用lentivirus转染ES或者SSC的文献

ying

整个板块号称是研究如何转染ES，但看起来全都是讲如何包装病毒、如何做感受态之类的很基本的东西。有哪位达人手上有专门讲如何转染干细胞特别是ES或者SSC的文章？希望能包括如下一些内容：6 w( K: e) m* g7 ?/ S$ |$ o
1，需要的病毒滴度；( F0 ?, x) V( M; Q: x8 _  ]
2，ES（或SSC）的转染的目的基因（或RNA)promoter的选取的特殊性，和各个promoter的强弱关系（CMV，EF1a,CAG,H1,U6等）和它们的适用情况；
6 y3 b/ o, I1 L) @) k; F5 b' ?3，与基因表达后被细胞沉默相关的知识，比如说CMV转到ES之后会沉默但细胞分化后会重新开启吗？
! p  `7 v  f' S) Q, @7 X& S4，用何种protocol转染，具体程序，包括如何铺细胞，加不加MEF做feeder，加不加polybrane，转染几个小时，转后何时换液，最后何时检测阳性细胞，第一次转染一种ES的时候各种条件怎么摸（哪些条件要摸个小梯度），如何用药物筛选阳性（包括如何做药物浓度的曲线）；
! u8 }8 p4 ]" Y( [& t5，各种trouble shooting。7 a1 o2 ~& m7 k6 a2 a
期盼各位达人的指导。我是做SSC的，需要转染lentivirus。昨天在这里也看到一位网友要做这个实验。; g+ A: L/ k4 L( W" n! L& d
我对做这一块非常没有经验，从文献和各个同学的反映来看，这一行的水也很深，鄙人觉得亚历山大～

ghfvcat

这个问题太大了，没看到有这么全的文章，你从公司买的话，倒可以仔细问问。
$ O% n  i+ {; u; [. D9 {1：需要的滴度和细胞类型有关，一般给出的有效滴度都是以包装细胞如293T之类为靶细胞感染测量的，不同的靶细胞需要先测试下感染效率。以90%以上的阳性率为达标。0 c/ N) _# K  T! W, c, E
2：除非有文献报道说某个启动子不能使用，一般CMV,EF1a之类都是常用的。可以通过报道基因来看一下效率。
0 q7 y- p7 w3 _: X; M3：不清楚，CMV被沉默好像也不是百分百的，只是表达量稍低吧？# k2 v/ q- p. t. \& `! I
4：病毒进入靶细胞，不能叫转染了，应该叫感染。转染是前期包装病毒时的操作。至于feeder cell，最好在无饲养细胞的时候操作。polybrene是用来增加感染能力的，有一定细胞毒性，需要试试浓度，不加就能感染的话，就不要加了。药物筛选和普通细胞一样。; M& p5 O( Q$ T* L  G+ [1 s$ A! y
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runsong

同求 帮顶

gact

ES中会感染病毒的，至于CMV沉默也有人提过，这方面的文献还没看到。。。

寒山拾得

ES中不同promoter 活性文献

chips100

前几天刚慢病毒做了个干扰，CMV驱动荧光，荧光有强有弱，选强的就行了，荧光看起来也挺好。
+ v- Z+ H$ K1 T; m  ^0 {1 O1，需要的病毒滴度；
1 d3 O; D& O  l3 \; ~---------------直接病毒液转，不测滴度
3 u5 y( f  U; r1 r. }9 C2.和各个promoter的强弱关系（CMV，EF1a,CAG,H1,U6等）和它们的适用情况；
0 D2 B7 P, ]- D& u( R1 A----------个人以为绝对的强弱可能并不明显，可能跟插入位置有关，当然有人说EF1比较强。& A% k$ n) p* ^1 w& b+ N
3.与基因表达后被细胞沉默相关的知识，比如说CMV转到ES之后会沉默但细胞分化后会重新开启吗？)
1 V+ y+ P4 w# W----------沉默为什么会影响分化呢
' [" e. R3 Y9 E) ]4，用何种protocol转染，具体程序，包括如何铺细胞，加不加MEF做feeder，加不加polybrane，转染几个小时，转后何时换液，最后何时检测阳性细胞，第一次转染一种ES的时候各种条件怎么摸（哪些条件要摸个小梯度），如何用药物筛选阳性（包括如何做药物浓度的曲线）
8 M6 h1 H& q% g; {& I------------------加mef，不加polybrene，当然推荐加  i8 ?" Q2 N7 @8 T% Z$ W8 n
5 各种trouble shooting。. s" F3 v9 }- u" _/ K
------------------没什么trouble