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猪胚胎操作各种液体配方:3 }- s8 k H$ D& |- M3 k' P
(1)洗卵液:改良TL-Hepes-PVA液,用0.22 μm一次性滤器过滤除菌,按40 mL/瓶分装并用封口膜封口保存于4°C备用,使用的前天晚上放入39°C恒温箱预热。+ Y& W( `; ~" n, l
(2)卵母细胞体外成熟培养液:改良TCM-199液(Gibco, GrandIsIand, NY, USA),其中添加3.05 mM D-葡萄糖、0.91 mM丙铜酸钠、 75 μg/mL青霉素、50 μg/mL链霉素,用0.22 μm一次性滤器过滤除菌,按40 mL/管分装并用封口膜封口保存于4°C备用即为储存液A;储存液A添加0.57 mM半胱氨酸、10 ng/mL EGF,用0.22 μm一次性滤器过滤除菌,按10-12 mL/管分装并用封口膜封口保存于4°C即为储存液B;使用的前天晚上储存液B添加10% pFF、10 μg/mL FSH、10 μg/mL LH即为工作液A,第二天晚上储存液B添加10% pFF即为工作液B。+ ], ^6 d+ w$ s, H* j
(3)胚胎培养液:NCSU-23,用0.22 μm一次性滤器过滤除菌,按40 mL/管分装并用封口膜封口保存于4°C备用即为储存液;储存液添加0.4% BSA,溶解后用0.22 μm一次性滤器过滤除菌,按10-12 mL/管分装并用封口膜封口保存于4°C备用即为工作液,使用的前天晚上放入39°C二氧化碳培养箱预平衡。& v. m# A, @) u0 {$ k2 V
(4)6-DMAP液:NCSU-23 + 0.4% BSA + 2mM 6-DMAP,用0.22 μm一次性滤器过滤除菌,按10-12 mL/管分装并用封口膜封口保存于4°C备用即为工作液,使用的前天晚上放入39°C二氧化碳培养箱预平衡。
$ N; [/ v' V; D' M5 ]7 t$ j5 p$ t(5) 操作液:洗卵液 + 10% FBS,用0.22 μm一次性滤器过滤除菌,按10-12 mL/管分装保存于 - 4°C备用即为工作液, 使用的前天晚上放入39°C恒温箱预热。
: T( S0 @+ A6 K" u6 I(6) 融合/激活液的配制:0.25 M甘露醇 + 0.1 mM/mL MgSO4 + 0.1 mM/mL CaCl2 + 0.5 mM Hepes + 0.01 % PVA,用0.22 μm一次性滤器过滤除菌,按10 mL/管分装保存于 - 20°C或 - 4°C备用,使用的前天晚上放入39°C恒温箱预热。
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