关于qPCR 表达量的问题探讨

heiguzi1988

1，高表达转录本是适合两步法还是一步法呢？: a; B4 H  j, D* }3 C2 K
    我的基因是高表达，我同时用了两步法、一步法的方法，但是，结果却很不同！这样让我很是费解。因此请教各位专家，这两种方法哪种更适合我的基因。. c9 a4 y0 Y; y  Y+ S2 t+ ^7 r
2，请问反转录试剂盒用oligo T和random prime这两个办法是不是出来的结果可能也会不同？是否也有人一起加呢（各一半的加）？
" ^5 _7 Q6 `( S- g- v: O, k2 g& \( E. k- t3 {
感谢！！！！！！！！！

ilovelife

一直用两步法，对一步法没有经验。
) s5 [* t( t" {# A; @0 Z! Y引物倒是都用过，但是在不同时期，没有一起side by side做过对比实验，oligodT针对的是poly尾巴，你的要是高表达，用oligodT引物应该不错吧。
$ b# `% K5 I3 p* m3 W7 v6 r你用的是realtime PCR吗？我想你应该先做模板梯度实验摸条件，我一般是做10倍梯度稀释，共稀释至少4个梯度，我一般稀释6个梯度。有时对idNTP、引物浓度也需要摸条件，祝你好运。

ellapan

没用过一步法 我甚至不知道这两种的区别，自己一直采用的是二步法。

goodboy

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7 p% }# a, A" I# |; `& L, r1 n: S& u+ N0 T9 ?( ?% {6 F
看你扩增片段的性质和位置了，如果在3‘端用oligo dT没问题，如果在5’或GC含量高用random，如果不放心的话也可以用各加一半。还有oligo dT只能扩增mRNA,而不是用于rRNA等