关于qPCR 表达量的问题探讨

heiguzi1988

1，高表达转录本是适合两步法还是一步法呢？
$ q, R& {2 x5 [0 r; O" w. I    我的基因是高表达，我同时用了两步法、一步法的方法，但是，结果却很不同！这样让我很是费解。因此请教各位专家，这两种方法哪种更适合我的基因。( h% ~! [+ d9 M: ]4 k4 L
2，请问反转录试剂盒用oligo T和random prime这两个办法是不是出来的结果可能也会不同？是否也有人一起加呢（各一半的加）？+ c1 z3 ^3 D5 n9 t/ K
( D- O8 A0 a6 b" `( k
感谢！！！！！！！！！

ilovelife

一直用两步法，对一步法没有经验。6 b8 ]& W# S6 Q( w; N0 \
引物倒是都用过，但是在不同时期，没有一起side by side做过对比实验，oligodT针对的是poly尾巴，你的要是高表达，用oligodT引物应该不错吧。2 z3 a2 X1 f+ z; y- i- N9 z
你用的是realtime PCR吗？我想你应该先做模板梯度实验摸条件，我一般是做10倍梯度稀释，共稀释至少4个梯度，我一般稀释6个梯度。有时对idNTP、引物浓度也需要摸条件，祝你好运。

ellapan

没用过一步法 我甚至不知道这两种的区别，自己一直采用的是二步法。

goodboy

回复 heiguzi1988 的帖子
: a5 N( T( n6 A* h2 T$ C) v9 r, q' I8 J0 |* E' H; L- l
看你扩增片段的性质和位置了，如果在3‘端用oligo dT没问题，如果在5’或GC含量高用random，如果不放心的话也可以用各加一半。还有oligo dT只能扩增mRNA,而不是用于rRNA等