关于qPCR 表达量的问题探讨

heiguzi1988

1，高表达转录本是适合两步法还是一步法呢？* O  p2 F7 l1 m! d8 `* A
    我的基因是高表达，我同时用了两步法、一步法的方法，但是，结果却很不同！这样让我很是费解。因此请教各位专家，这两种方法哪种更适合我的基因。
1 ^, K& [8 c& N, }) B- s$ ?' R. Q2，请问反转录试剂盒用oligo T和random prime这两个办法是不是出来的结果可能也会不同？是否也有人一起加呢（各一半的加）？* C) y; Q: k* B5 b8 A

8 Y+ [+ K8 M( P感谢！！！！！！！！！

goodboy

回复 heiguzi1988 的帖子2 i1 v( S2 y/ N7 Z* H  d! y, P

2 u/ k8 }' L* H% y  o4 g& Z看你扩增片段的性质和位置了，如果在3‘端用oligo dT没问题，如果在5’或GC含量高用random，如果不放心的话也可以用各加一半。还有oligo dT只能扩增mRNA,而不是用于rRNA等

ellapan

没用过一步法 我甚至不知道这两种的区别，自己一直采用的是二步法。

ilovelife

一直用两步法，对一步法没有经验。
' x7 Z$ f4 R0 C2 \* E引物倒是都用过，但是在不同时期，没有一起side by side做过对比实验，oligodT针对的是poly尾巴，你的要是高表达，用oligodT引物应该不错吧。3 W5 T. {; N2 r2 r) R- L8 s
你用的是realtime PCR吗？我想你应该先做模板梯度实验摸条件，我一般是做10倍梯度稀释，共稀释至少4个梯度，我一般稀释6个梯度。有时对idNTP、引物浓度也需要摸条件，祝你好运。