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不同的细胞已及转不同面积的孔板操作起来略有不同,以转染六孔板的贴壁细胞为例:
& a; d1 s5 g8 p1.接种细胞。转染前一天将细胞接种至六孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定,一般为1×106个细胞。转染时要求细胞汇合度为90~95%。转染前两小时对细胞进行换液。+ a7 R: C- \9 {% o
2.将4ug的质粒DNA加至250ul的OPTI-MEM培基中,混匀。( t/ V' O' [3 S' ]" }+ @- m1 e
3.将10ul的Lipo2000加至另外250ul 的OPTI-MEM中,轻轻混匀,室温静置5分钟。
1 Y/ i) U/ U+ Q2 S2 \' W2 F' x7 Q4.将DNA悬液和Lipo2000悬液混合,总体积500ul,轻轻混匀,室温静置20分钟。
3 a, V! h3 v; u! I6 s; X5.将DNA和Lipo2000混合液加至六孔板的孔内,前后左右晃动孔板混匀,置于培养箱中培养。( j$ C) l$ C% \. t' b$ k
6.转染4-6小时后,细胞换液,每孔2ml培基。) {' I6 B' T- f% I6 G- ~
7.转染18-48细胞后,收集细胞检测表达,或加入抗性培基筛选稳定表达克隆。
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3 x; _$ h# t; q注:1. 如果没有OPTI-MEM培基,用培养细胞的无血清基础培基替代也可以。
& Z. r1 b A) w1 k8 w: x0 v" F 2. 该说明为一个孔的用量,同时转几个孔时按需加倍。若转染其他类型孔板,DNA和Lipo2000用量参见试剂盒说明书中的表格。可根据实际质粒和细胞的转染效率,分不同量摸索最佳DNA和Lipo2000的混合比例。
, a T* O6 c1 @, L 3.转染4-6小时后也可以不换液,但由于Lipo2000具有一定的细胞毒性,作用时间过长可能使某些细胞出现大量死亡现象,建议换液。
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