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不同的细胞已及转不同面积的孔板操作起来略有不同,以转染六孔板的贴壁细胞为例:+ m5 q! ]: L. f8 W# @
1.接种细胞。转染前一天将细胞接种至六孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定,一般为1×106个细胞。转染时要求细胞汇合度为90~95%。转染前两小时对细胞进行换液。6 H( L$ \) P* k0 }' Q
2.将4ug的质粒DNA加至250ul的OPTI-MEM培基中,混匀。
, f5 S3 L- b# q* }3.将10ul的Lipo2000加至另外250ul 的OPTI-MEM中,轻轻混匀,室温静置5分钟。0 ~' r, e, Q! ] Y: T4 d
4.将DNA悬液和Lipo2000悬液混合,总体积500ul,轻轻混匀,室温静置20分钟。6 Z6 e- \; n/ f/ v! _
5.将DNA和Lipo2000混合液加至六孔板的孔内,前后左右晃动孔板混匀,置于培养箱中培养。
" l; [2 a& O! s8 F% G* S: W6.转染4-6小时后,细胞换液,每孔2ml培基。% \$ m/ p6 J1 G6 _. f# ]
7.转染18-48细胞后,收集细胞检测表达,或加入抗性培基筛选稳定表达克隆。
, Q' h5 s4 P9 U9 S ~3 e+ L" a6 m
注:1. 如果没有OPTI-MEM培基,用培养细胞的无血清基础培基替代也可以。
9 g; Q( p+ M6 g 2. 该说明为一个孔的用量,同时转几个孔时按需加倍。若转染其他类型孔板,DNA和Lipo2000用量参见试剂盒说明书中的表格。可根据实际质粒和细胞的转染效率,分不同量摸索最佳DNA和Lipo2000的混合比例。
) j8 X5 K0 _& B3 T) Z8 s/ {; w! T 3.转染4-6小时后也可以不换液,但由于Lipo2000具有一定的细胞毒性,作用时间过长可能使某些细胞出现大量死亡现象,建议换液。* F+ o1 y2 C. ?" Y! l+ X
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