RNA抽提方法试剂和试剂盒的选用 注意事项等 有疑问的可以来讨论

燕北飞

RNA抽提方法试剂和试剂盒的选用 注意事项等 有疑问的可以来讨论，因为RNA容易降解，想抽出高质量的RNA是有些难度的。

刘森泉

我们实验室一般就用trzol抽提，takara试剂盒做RT-PCR。燕北飞有好的试剂盒，方法推荐，可以把你们实验室详细的操作方法传上来分享下。谢谢！

lazyworm

trizol提取。专门的RNA室，戴手套口罩，枪头EP管经DEPC水处理。其实也没那么容易降解，

linzi214

细胞较多的时候就用Trizol试剂来做，做实验时小心一些一般都没问题的；极少量细胞的话有专门的RNA抽提试剂盒

燕北飞

回复 刘森泉 的帖子$ Q+ @  A8 {6 A1 b6 y

9 l# K. z  H' Q8 i多谢来捧场啊！实验方法差别不大，主要是在抽提时加入DNA酶，防止DNA污染，这样定量更精确。

shewawa

我们先用ＱＩＡＧＥＮ的RNAlater处理细胞后用RNeasy Mini Kit提取RNA，途中用专门的RNase处理酒精。. [5 B: j9 G: \% z) n
但是我水品不好，每次都看到电泳观察，都能看到ＲＮＡ被分解的条带，哎！请问大侠分有没有好的方法可以让提取的ＲＮＡ条带很漂亮的出现在电泳里啊？

ielisa

以前用的是trizol抽提，现在用QIAGEN的试剂盒了，其实抽提RNA的实验做得次数多了自己慢慢就会知道要点在哪里了，也不是那么易降解的，建议你做实验的枪头，EP管等都事先用DEPC水浸泡过夜并灭菌后晾干，然后放到专门的柜子，用的时候再取出，还有就是实验过程中戴手套和口罩，并且尽量少讲话

flyingpnmc

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. Z! G' _) u0 e转载生物通的链接，关于Trizol提MiRNA的问题，希望对大家有点参考作用。: m% g& }" }; n1 R; P$ _
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TRIzol影响实验结果？miRNA文章被撤回
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生物通报道 韩国首尔大学的科学家Narry Kim（金娜蕊）及其研究小组近日撤回了一篇关于microRNA（miRNA）衰减的文章，因为她们发现，所用的TRIzol试剂会对富含GC的miRNA或具二级结构的miRNA产生不同影响。
" S' _9 A; z  e这篇文章去年发表于《Molecular Cell》杂志上。研究人员发现，一旦细胞粘附性丧失，某些miRNA迅速降解。当他们以低密度培养细胞或用胰酶或EGTA解离细胞时，细胞内成熟miR-141表达水平显著下降，而来自同一个转录本（pri-miR-200c~141）的miR-200c不受影响。当细胞解离时，放线菌素D对转录的阻断导致miR-141的迅速耗尽，半衰期不到1小时，从而表明miR-141是通过高速衰减而导致表达水平发生迅速改变的。在进一步的研究中，研究人员通过其他的miRNA包括miR-200a, miR-34a, miR-29b, miR-301a, 和 miR-21再次验证了这一调控机制。
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然而，Narry Kim研究小组近日撤回了该文章。她们在撤回声明中写道：“基于我们的结果，我们认为，一些miRNA会根据细胞的粘附状态而选择性丧失稳定性。然而，在后续研究中，我们发现，低GC含量的miRNA（如miR-141、miR-29b、miR-21、miR-106b、miR-15a和miR-34a）会在样品制备阶段选择性丢失，而不是在细胞中降解。” * y8 V9 N; J5 ?- t6 @
此外，Kim及她的同事还发表了新的数据，将TRIzol RNA分离方法与另一种不太常用的mirVana方法进行了比较，应用在高密度和低密度细胞样品上。利用TRIzol，她们发现，低密度培养物中的miR-141水平低于高密度培养物。然而，利用mirVana方法，两者只有轻微的差异。
5 _8 y  _" w9 i% n" B) W2 Z作者认为，两个操作步骤的数据不一致提出了一个严重的问题，即某些miRNA可能在RNA制备过程中丢失，这取决于选择的操作步骤。 . u6 v! l* C; z' r& U
Kim谈道：“科学家不可避免地会承认一些假设，而它们后来被证明是错误的。我们也存在一些技术限制，而在研究的时候未被发现。因此，得出错误的结论有时是不可避免的。最重要的是要诚实，一旦我们意识到，就要纠正错误。”& I# S  B3 ?& h2 u
对于miRNA的分离，很多实验室都是使用TRIzol试剂。但从这篇文章的结论来看，TRIzol很可能会影响部分实验结果。吸取Narry Kim的教训，大家最好还是采用两种分离方法，来验证结果的可靠性。同时，希望Life Tech的研发部门好好研究一下，发布更为可靠的操作步骤。（生物通 薄荷）
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Retraction Notice to: Cell Adhesion-Dependent Control of MicroRNA Decay 2 a7 v  h/ P, T; c
(Molecular Cell 43, 1005–1014; September 16, 2011)
2 v7 n. w- K0 |' I2 s# f9 Y4 mIn this paper, we reported that the levels of specific microRNAs (miRNAs) decrease when cells are grown at low density or when cells are detached from a culture dish. Based on our results, we proposed that some miRNAs are selectively destabilized depending on the adhesion status of the cells. However, in subsequent studies, we discovered that structured miRNAs with low GC content, such as miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a, and miR-34a, are selectively lost during sample preparation rather than degraded in the cell. The small RNA loss occurs when a small number of cells is used for RNA preparation using the standard TRIzol protocol (see Kim et al. [pp. 893–895] in this issue for details). These findings provide an alternative explanation for our original data. While the original data are all reproducible, we are retracting the paper because we feel the main conclusions have been compromised. We apologize for any inconvenience this may have caused.

fish_zbw1985

一般进口枪头和EP管都是除RNA酶的 我的个人经验是细胞多的时候用Trizol试剂 细胞少的时候用QIAGEN mini试剂盒提取 我觉得对RNA提取最关键的步骤是充分裂解  裂解不充分很容易导致最后提取的RNA质量偏低  至于降解问题 可以通过加入巯基乙醇做保护

刘志红

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6 m1 v" R; a9 C( ~个人感觉在提取之前进行细胞破碎的时候使用液氮比较好，使用熔浆器效果不好，而且实验过程中速度要快。