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本帖最后由 xuexi123 于 2016-1-19 17:42 编辑 & ~' V2 e8 A% C- A" m" i- k2 w7 u
* B" n* \* V. ?9 P: v培养材料:
& z/ t5 `. g3 k& e5 ^$ I! K" U无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
* w! @' F A! U) s. a% `细胞因子:IL-2(1000IU/ml)、Anti-Human CD3(5ug/ml)、IL-12(500IU/ml)、IL-15(500IU/ml): P# X. {# a( w$ y: q1 O
6 |8 i- Z+ s1 u& x操作步骤:9 X% q/ p0 |# I5 n
2 ]& M7 Q' l) v# i. f- Z9 p+ ^1、采血机采集外周成分血50ml ,用生理盐水1:1进行稀释,1 v6 L' l# v' M# K! O5 j4 H! P! o! G0 i2 h# K: j
2、由Ficoll液分离,去红细胞,收集初步纯化的单个核细胞:经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞,Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管,没管加入15mlFicoll分离液,将25ml单核细胞悬液,贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上,注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面,离心2000rpm/min,20min,升速1,降速0,离心后,液面分为四层,小心吸取第二层的单核细胞层,用无血清GT-T551洗涤2次,离心1800rpm/min,5min,20℃,弃去上清,再用5ml无血清培养液混悬。: [5 D) x) d7 b& u$ Z/ g2 a/ O$ q) Z1 [* i9 C
3、细胞计数:吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内,另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液,用血球计数板进计数。4 j7 Z7 M) F# i& H9 b0 x* m4 d
* M! m0 \8 c7 m% [! f4、将PBMC密度调整为2X106/ml,转入T75瓶中,培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15,并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液,并补充相应的细胞因子和自体血浆。
2 y8 L6 T! _) A" x+ ^' b5、收集悬浮细胞:培养第10d观察NK细胞并收获NK:将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中,1800rpm,离心5min。去上清,用生理盐水再洗细胞2遍,最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中,转入细胞回输袋内,制成NK回输液。; e* N% x1 Y$ P8 T3 r1 h
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