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本帖最后由 xuexi123 于 2016-1-19 17:42 编辑
: P" o! K2 e) D9 w1 D6 W1 b8 z
7 P6 { }$ [1 J' P* O5 y& V培养材料：1 X1 p$ t9 o6 c, z2 x
无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
( Q8 b5 v# Z. {* [" q {细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）: P# X. {# a( w$ y: q1 O
! a& I$ ^2 p J Z/ K- _: Q/ l操作步骤：9 X% q/ p0 |# I5 n, x, ~6 D& k' X
1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，1 v6 L' l# v' M# K! O
3 G" D* r- e d% `2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。: [5 D) x) d7 b
3 E* X+ ?5 Y8 \3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。4 j7 Z7 M) F# i& H9 b0 x* m4 d
2 s8 T8 z" ~0 z" m& X6 q! b m, v4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
! `1 T0 D" O: e* ^5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。
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发表于 2016-1-19 17:29
