小鼠胚胎干细胞培养几天后贴壁不牢换液容易飘走怎么办？

天龙八部

我在明胶包被过的6孔板培养B6小鼠胚胎干细胞系，明胶包被2h，弃明胶后复苏小鼠mES培养，每天换液。换液前培养基平衡至室温。传代后细胞大量漂浮，类似EB球。没扔，观察了几天，没漂浮的零星几个克隆仍然在长，大部分漂浮的不再贴壁，像EB球一样。这个问题怎么解决啊？
8 I6 ~8 W2 [, z# O# S7 ?我想到的是换液前培养基平衡至37℃，和细胞温度相同，而不是平衡至室温。希望各位能谈谈自己的看法，谢谢！

康小纬

你上网查一下小鼠的胚胎干细胞有没有悬浮的，我们实验室养的大鼠的ips大部分都是漂浮的，只有少部分是贴壁的，这些都是属于正常现象，换液的时候就把上清液离心，然后用新的培养基重悬加入皿内即可

天龙八部

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9 t* `+ m! z/ k, k8 C- [谢谢！我再查查文献。不过目前看到的文献里没有用悬浮培养法维持小鼠mES生长的。只有培养EB球时用悬浮培养。

abcstem

回复 天龙八部 的帖子0 P2 j) v$ r9 ^. M) q) J/ d
; R' u4 K2 P5 Z0 b" T# F8 i
你用的什么培养液？含血清培养液，小鼠ES细胞是贴壁很好的。无血清培养条件下贴壁不好。

天龙八部

回复 abcstem 的帖子: d! g! E* p6 Y
) [* V; x7 v" J' c# H# k
在MEF上养的细胞用的含有15% FBS的培养基；明胶上养的细胞不含血清。

abcstem

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7 u9 ?" Z1 c, @6 E, W2 j
无血清条件下小鼠ES细胞在明胶上培养时是贴壁很差的。

meredith603

为什么要在明胶上做ES的无血清培养？好歹也要换个细胞基质比如matrigel啥的吧，明胶太基础了。

splinkerette

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9 p6 ~, ]# N" M8 S% m' `) w* Z' T
; ^  x" {/ n8 Z, ~$ R  V/ I小鼠胚胎干细胞的确没有用悬浮方式培养的。
& z3 J: a7 @: K) D% G无血清情况下贴壁确实很差。: T9 B2 M. T7 t' g. L: z8 |- I; S# H
你是用的无血清培养基？是Austin Smith实验室的2i+LIF的培养基吗？

anning111

大小鼠的IPS都可以加点FBS让他贴，还可以加ROCK 抑制剂也行，如果要进行无血清培养的话，可加入KOSR，这个能让IPS、ES贴的

anning111

你可能用的培养基不对，你可能用的是DKO+2i,就是20%KOSR+2i,试试别的培养基。
1 P; O. T3 y0 N+ [. ~9 T& b1 f$ ~& }4 u8 w! {- k6 p
1，用冰冷的0.2%gelatin5ml 铺在10cmdish,37度5分钟，这是采用热胀冷缩的原理将胶原固定在dish上' r, B( S; b  H8 r9 ?
2，用BESM20%FBS+DMEM或者10%FBS+N2B27+2i贴壁过夜，
. R4 V. ~# i" q% T3，第二天换上N2B27+2i 培养基
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& u1 \; x3 o- Q3 V, A: W# @+ p0 v保证细胞长得好