小鼠胚胎干细胞培养几天后贴壁不牢换液容易飘走怎么办？

天龙八部

我在明胶包被过的6孔板培养B6小鼠胚胎干细胞系，明胶包被2h，弃明胶后复苏小鼠mES培养，每天换液。换液前培养基平衡至室温。传代后细胞大量漂浮，类似EB球。没扔，观察了几天，没漂浮的零星几个克隆仍然在长，大部分漂浮的不再贴壁，像EB球一样。这个问题怎么解决啊？( m# b- F# V  x6 `
我想到的是换液前培养基平衡至37℃，和细胞温度相同，而不是平衡至室温。希望各位能谈谈自己的看法，谢谢！

康小纬

你上网查一下小鼠的胚胎干细胞有没有悬浮的，我们实验室养的大鼠的ips大部分都是漂浮的，只有少部分是贴壁的，这些都是属于正常现象，换液的时候就把上清液离心，然后用新的培养基重悬加入皿内即可

天龙八部

回复 康小纬 的帖子1 q2 \- B8 Z, [8 n) G

; O" o3 ?. z4 h/ S8 C谢谢！我再查查文献。不过目前看到的文献里没有用悬浮培养法维持小鼠mES生长的。只有培养EB球时用悬浮培养。

abcstem

回复 天龙八部 的帖子+ m) b5 v% J" X0 q) `+ g5 y
) `& U9 U8 E1 f+ i6 G% i
你用的什么培养液？含血清培养液，小鼠ES细胞是贴壁很好的。无血清培养条件下贴壁不好。

天龙八部

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6 P, [% y! b; h5 k# k3 i
# J! `1 J1 a4 \/ R" i' B在MEF上养的细胞用的含有15% FBS的培养基；明胶上养的细胞不含血清。

abcstem

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无血清条件下小鼠ES细胞在明胶上培养时是贴壁很差的。

meredith603

为什么要在明胶上做ES的无血清培养？好歹也要换个细胞基质比如matrigel啥的吧，明胶太基础了。

splinkerette

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" j6 z# c: K2 ?2 j& V- E0 R# B% S8 ~! k2 I  M
小鼠胚胎干细胞的确没有用悬浮方式培养的。
+ X# K! c% |  L3 n. L! N无血清情况下贴壁确实很差。
2 A- v6 ?& }& V9 Q7 d你是用的无血清培养基？是Austin Smith实验室的2i+LIF的培养基吗？

anning111

大小鼠的IPS都可以加点FBS让他贴，还可以加ROCK 抑制剂也行，如果要进行无血清培养的话，可加入KOSR，这个能让IPS、ES贴的

anning111

你可能用的培养基不对，你可能用的是DKO+2i,就是20%KOSR+2i,试试别的培养基。
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9 z9 q- s" p3 x: G7 m7 _* q1，用冰冷的0.2%gelatin5ml 铺在10cmdish,37度5分钟，这是采用热胀冷缩的原理将胶原固定在dish上
9 [, y' F6 \% R- O4 v  C2，用BESM20%FBS+DMEM或者10%FBS+N2B27+2i贴壁过夜，
/ b1 k7 ]# T4 d7 u8 I1 E: l/ C3，第二天换上N2B27+2i 培养基
+ e. _8 g) M4 a0 N; k
) S9 Q: w" z5 z; t: Z+ _保证细胞长得好