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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-17 15:56 编辑 ; v1 T* s1 U. X* `
- [1 Y) T6 Y5 {& s; ?6 O8 H. v
第三天中午,差不多复苏后50小时左右,观察细胞& h8 w% N! d+ b' J) I5 b. E5 y
u6 ]" a* l% B" H( g" c, P
( v$ U& p8 E3 a& Y) X
不同的实验室消化传代的方法不同,我的方法可供参考:/ Z+ y6 I2 ~5 k7 {8 h2 o
* R/ J7 U, |! F; g
实验前准备:, d5 C0 x# y- }: x0 X; @
(1)DMEM+10%FBS
# H) K9 p9 C; ]# r" ~+ L$ `3 {' p# R(2)PBS
" M2 v" g) l; b [(3)0.25%胰酶( V; L$ [$ D5 v) y7 O; G- }" f
(注:同样这些试剂要平衡到常温再做实验)* ?% z9 M0 I. A) c
4 p$ h$ s/ R1 @+ x7 \4 H/ x+ k) X实验步骤:
: b( r, d( t/ G# `, q(1)弃去T75瓶中的原液。. C+ N' b% k7 [- G7 L
(2)加入5mlPBS洗一遍,洗去残留的血清。
, J2 ^1 t) K- H( j' ?, l- U(3)加入3ml胰酶,大概常温放置1-2min。
, D& g5 y, b. Z! K5 B(4)加入6ml新鲜培养基中和胰酶,并轻轻吹打内壁上的细胞。
, `- V# X" ]$ t& h' m5 [(5)将内壁上的细胞吹打下来后,充分吹打细胞液,使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大,3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧,呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧,也有人吹打5-10min。
4 t, A! | d% @(6)吹打成单细胞悬液后,转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。4 |6 s& b" @( M
(7)离心期间另外准备两个T75瓶,加上原瓶,共三个T75培养瓶,分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后,用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后,平均转移至三个T75瓶中。混匀。
$ o' G" i* K' f- D7 C4 o: m# U; n% y z- P(8)放入温箱培养。
* p, t9 i3 f# }+ P/ f, K7 q(注:我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶,也就是1:3传。) |
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