求助成年小鼠SVZ取材详细步骤

yhy313

成年小鼠SVZ取材及原代培养的详细步骤。谢谢！
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以下是从第三军医大博士毕业论文上摘下来的，请各路高手指导，看是否需要改进，主要是想在SVZ取材方面获取指导，非常感谢！
) J) u; I9 A* Q5 ]1．        取8周龄C57雄性小鼠，腹腔麻醉。- C7 J/ A; o! g# G, v' X
2．        头部70％酒精消毒。' q- ~  \9 u' G2 w7 z
3．        剪刀从颈部断离头部，剪开头皮、颅骨，取出大脑，置于盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中。
3 }/ N' F" @: D4 B% Q/ \& p1 ^4．        去除血迹，放入另一盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中，去除脑膜，在显微镜下操作。
, `1 @7 g6 a1 L5．        将大脑约1／2处横断，保留前脑(近嗅球端)，沿中线分为两半。
. W7 ]0 G; K' B" W. U6．        将半脑外侧面朝下，用一只镊子固定，另一只镊子去除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。
! ^( D! y1 U" Z# }; L9 S/ I7．        分离之，去除四周的白质纤维。取出置于无菌的1．5毫升Eppendorf离心管中，置于冰中。' _. C/ l; M( c1 d* ]
8．        同样分离另一侧的。
. K& ?% ^1 t2 T9．        每个离心管中加入400ul的0.1％含EDTA的胰酶。* Z3 S" F! m% t" Q) i- r
10．        轻柔吹打5～10次，将组织吹打成细块状(使用1000ul的蓝色枪头)。
/ X0 b0 U) W+ y! L8 f; @5 n% B) o, b11．        37℃孵育10分钟。每个样本组织再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织消化成小的颗粒。3 W% f. N0 Z4 z# F; X
12．        37℃再次孵育10分钟，再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织完全消化成单个细胞。
0 v# e) s4 x( P7 u- n- d13．        可以酌情延长消化时间和次数，最终使得组织完全消化成单个细胞。8 f& e$ d& O0 T# y6 }" w" D8 K. I
14．        每个离心管中加入4001xl的NSCs培养基终止消化。
) Z9 f. _# o7 t4 w15．        常温下O.3 rcf离心3分钟。
7 J* J4 J) c/ Z. P% |% R# \9 l16．        去上清，加入培养基洗涤一次，再次0．3 rcf离心3分钟。8 i, N) c$ d* u1 v& p1 U8 R
17．        去上清，加入培养基轻柔的重悬细胞。5 ^% X7 g  f/ I$ [8 Q7 ^
18．        移入50ml的培养瓶中培养，每瓶加约10ml培养基（培养基为DMEM/F12(1:1)，每50ml中添加了青霉素．链霉素500微升，N2 500ul， B27 1ml，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)20ng/ml）。约7～8天后神经球形成。4 n( T: t9 y) {7 N
19．        将培养瓶放置在倒置显微镜下进行神经球计数。: V7 P# W# \2 h/ T
20．        在24小时后换液一次，换出死细胞和其它杂质。+ o! ^7 r6 [  s! w
21．        观察到神经球长到约200um大小时即可传代。

iseeyou1210

very good!

yhy313

另一种取材方法：
: f* O1 E2 s0 y" S" b0 T* u. ]+ F" R

ambassador

我来补充一下SVZ神经干细胞的知识吧！4 J8 e0 {( W* W0 R2 M
附上这篇第三军医大学2003年发的：2 Z2 J6 V5 R# }0 S% k& x, A9 G$ y8 [  P
SVZ神经干细胞和祖细胞
$ R4 k* ]0 e* z, `$ j

beidouhan

不错的分享

smkx

谢谢

mumudan

请问楼主，你每次分离的时候都能看到明显的透明条带吗？能很准确的取到那个区域吗？我最近也在取，貌似方法不是很好，可否交流下！