求助成年小鼠SVZ取材详细步骤

yhy313

成年小鼠SVZ取材及原代培养的详细步骤。谢谢！2 x- S! Y& ?* \) o( c
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以下是从第三军医大博士毕业论文上摘下来的，请各路高手指导，看是否需要改进，主要是想在SVZ取材方面获取指导，非常感谢！
# p5 @! x- z  T% }8 v1．        取8周龄C57雄性小鼠，腹腔麻醉。
- i1 A( R" _$ N$ @& r, w4 D2．        头部70％酒精消毒。
' E* {8 H* x% n8 F7 F3．        剪刀从颈部断离头部，剪开头皮、颅骨，取出大脑，置于盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中。1 }7 W% k7 ^: u& S" ^. }
4．        去除血迹，放入另一盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中，去除脑膜，在显微镜下操作。
1 x7 X$ c! M) \5．        将大脑约1／2处横断，保留前脑(近嗅球端)，沿中线分为两半。
  Y* W5 l% D* V# ]6．        将半脑外侧面朝下，用一只镊子固定，另一只镊子去除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。
7 V* X* `! F, O  G/ @9 R7．        分离之，去除四周的白质纤维。取出置于无菌的1．5毫升Eppendorf离心管中，置于冰中。5 G# o& a) `, n0 {3 [! u3 `$ r" r8 P7 R
8．        同样分离另一侧的。! |. X0 I. l% E2 s+ F/ E
9．        每个离心管中加入400ul的0.1％含EDTA的胰酶。
& j: r9 B) N3 B2 U10．        轻柔吹打5～10次，将组织吹打成细块状(使用1000ul的蓝色枪头)。6 U$ v' b5 r+ a, R. r  r9 L
11．        37℃孵育10分钟。每个样本组织再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织消化成小的颗粒。. i- T% N5 o' s% i5 y4 D# R  \
12．        37℃再次孵育10分钟，再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织完全消化成单个细胞。
1 g5 o) G0 U7 V+ B13．        可以酌情延长消化时间和次数，最终使得组织完全消化成单个细胞。
# k+ g  [+ g- l! g* ^14．        每个离心管中加入4001xl的NSCs培养基终止消化。8 O, @2 {: S; l- K4 j6 e7 V
15．        常温下O.3 rcf离心3分钟。/ q% V/ k# L( i! s% k+ b4 X
16．        去上清，加入培养基洗涤一次，再次0．3 rcf离心3分钟。
. R6 ]7 q5 d7 `2 y/ c17．        去上清，加入培养基轻柔的重悬细胞。" L- o; O* u9 d. f5 `- J
18．        移入50ml的培养瓶中培养，每瓶加约10ml培养基（培养基为DMEM/F12(1:1)，每50ml中添加了青霉素．链霉素500微升，N2 500ul， B27 1ml，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)20ng/ml）。约7～8天后神经球形成。
& S9 R. \5 z& j3 a) T19．        将培养瓶放置在倒置显微镜下进行神经球计数。8 c% }" I. ~$ x* K: ^) N
20．        在24小时后换液一次，换出死细胞和其它杂质。
# J7 I  q% T3 K$ x. M, C21．        观察到神经球长到约200um大小时即可传代。

iseeyou1210

very good!

yhy313

另一种取材方法：+ w# l2 j$ w2 d( i

ambassador

我来补充一下SVZ神经干细胞的知识吧！# @  {  \5 w1 O
附上这篇第三军医大学2003年发的：" N$ d. k  v, u5 o
SVZ神经干细胞和祖细胞1 S4 ^  s' Q7 \8 ]. ~1 M. m

beidouhan

不错的分享

smkx

谢谢

mumudan

请问楼主，你每次分离的时候都能看到明显的透明条带吗？能很准确的取到那个区域吗？我最近也在取，貌似方法不是很好，可否交流下！