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成年小鼠SVZ取材及原代培养的详细步骤。谢谢！7 T% I; f% H9 P7 m
^- R; x+ `( p8 Q8 X1 x6 @以下是从第三军医大博士毕业论文上摘下来的，请各路高手指导，看是否需要改进，主要是想在SVZ取材方面获取指导，非常感谢！
& \) c( w, t' F- E4 _1． 取8周龄C57雄性小鼠，腹腔麻醉。
8 M% Z: @2 E1 N* D+ s2． 头部70％酒精消毒。6 W4 e# B G: [% o# }0 w- w
3． 剪刀从颈部断离头部，剪开头皮、颅骨，取出大脑，置于盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中。
( V, p2 }' M7 z1 ?4． 去除血迹，放入另一盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中，去除脑膜，在显微镜下操作。# f3 V3 A( M6 P. D+ N* M' v
5． 将大脑约1／2处横断，保留前脑(近嗅球端)，沿中线分为两半。 R3 z: ^ I1 i4 R
6． 将半脑外侧面朝下，用一只镊子固定，另一只镊子去除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。
. a& v$ p* @& s7． 分离之，去除四周的白质纤维。取出置于无菌的1．5毫升Eppendorf离心管中，置于冰中。
$ e$ L2 k* Y G* S4 U7 w& ?8． 同样分离另一侧的。; {' @' t3 N$ W& N) k$ G$ u9 M
9． 每个离心管中加入400ul的0.1％含EDTA的胰酶。
+ m8 u6 c, F6 i/ _10． 轻柔吹打5～10次，将组织吹打成细块状(使用1000ul的蓝色枪头)。" J7 x3 w: S I, g% U+ e& D J* a
11． 37℃孵育10分钟。每个样本组织再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织消化成小的颗粒。
* v0 I# R# Q% I5 H, [8 `: \. e12． 37℃再次孵育10分钟，再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织完全消化成单个细胞。
6 l) |: p4 Z! J; T( X13． 可以酌情延长消化时间和次数，最终使得组织完全消化成单个细胞。
# O* _ q$ I5 A: v w; z- w14． 每个离心管中加入4001xl的NSCs培养基终止消化。- U5 Q. |3 W& m# M" m/ ]
15． 常温下O.3 rcf离心3分钟。% n1 o5 h* r9 C+ A0 @7 r
16． 去上清，加入培养基洗涤一次，再次0．3 rcf离心3分钟。, w/ N5 b, k7 V
17． 去上清，加入培养基轻柔的重悬细胞。
/ i2 j1 ~3 \- V% ~" l9 o18． 移入50ml的培养瓶中培养，每瓶加约10ml培养基（培养基为DMEM/F12(1:1)，每50ml中添加了青霉素．链霉素500微升，N2 500ul， B27 1ml，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)20ng/ml）。约7～8天后神经球形成。2 f3 R. o# m X1 G, d: C
19． 将培养瓶放置在倒置显微镜下进行神经球计数。
. r! Q+ o; \$ J; E# A20． 在24小时后换液一次，换出死细胞和其它杂质。
4 O+ i9 n% A0 o21． 观察到神经球长到约200um大小时即可传代。 |
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发表于 2010-5-19 15:06
发表于 2010-5-21 14:38
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