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发表于 2009-3-3 12:27 |显示全部帖子 |倒序浏览 |打印

作者：王伟，张志坚，林建华，吴秀丽，余良宏，康德智作者单位：福建医科大学附属第一医院，福州 350005 神经内科，骨科，神经外科
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      【摘要】  目的  建立体外分离培养大鼠骨髓间质干细胞（MSC）方法，探讨MSC的扩增与鼠龄的关系及其部分细胞表面标志的动态改变。  方法  分别取2月龄和5月龄鼠骨髓，经密度梯度离心后取单核细胞层接种，待细胞长满后进行传代，隔日行细胞计数。对2月龄鼠的4代MSC分别进行表面标志抗原动态观察。  结果  2月龄鼠MSC的扩增率明显高于5月龄鼠MSC。流式细胞仪鉴定显示随着传代次数增多，CD 29 阳性率趋向升高;CD 90 阳性率趋于降低;CD 34 与CD 45 阴性率趋于升高。  结论  进行大鼠MSC培养扩增时MSC的取材可能要考虑大鼠月龄。在MSC培养扩增的过程中其表面抗原标志会发生变化，这些变化可能表示了细胞纯度的变化。

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      【关键词】干细胞;骨髓细胞;抗原，表面;大鼠
   　骨髓间质干细胞（MSC）在体内外诱导因子的作用下，可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞和星形胶质细胞转化，具有很大的可塑性［1-3］，使其在组织工程、细胞治疗等方面成为研究的热点。为更好地将MSC应用于研究，本实验通过体外细胞培养的方法将MSC从骨髓中分离纯化，观察MSC在体外的扩增与鼠龄的关系，并对MSC的部分表面抗原改变进行动态观察。
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　　1 材料与方法

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　　1.1 材料和试剂 2月龄和5月龄的清洁级SD雄性大鼠（上海医学科学院动物研究所），α-MEM培养液（GIBCO公司），胎牛血清（FBS，Hyclone公司），Ficoll-Paque淋巴细胞分离液（美国Pharmacia公司），青霉素、链霉素、PBS液、荧光标记小鼠抗大鼠抗体CD 34 -PE、CD 45 -FITC、CD 90 -FITC、CD 29 -FITC（美国Pharmacia公司）。

　　1.2 方法

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　　1.2.1 MSC的提取和分离分别取2月龄和5月龄的SD雄性大鼠各3只，平均体质量分别为200g和540g。2%戊巴比妥钠按45mg/100g体质量腹腔麻醉。无菌取出双侧股骨和胫骨。用α-MEM培养液（含1万单位肝素）10mL冲出骨髓，充分吹打混匀后叠加于Ficoll-Paque淋巴细胞分离液上（淋巴细胞分离液与骨髓液的比例1∶1.5），2000r/min离心30min，吸取中间的单核细胞层。加入α-MEM培养液5mL吹打混匀，1000r/min离心5min，对细胞沉淀再重复洗涤2次。
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　　1.2.2 MSC的接种与扩增分别向2月龄和5月龄大鼠细胞沉淀中加入含15鸖的α-MEM培养液，充分吹打后记数，调整细胞密度，按1.010 4 /cm 2 的密度接种于25cm 2 的培养瓶。培养液中含15鸖、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL。置于体积分数0.05的CO 2 饱和湿度的孵箱内37℃培养，2d后首次换液，弃去未贴壁的细胞后继续培养，每3～4d换液1次。不断观察细胞形态变化，待细胞基本长满瓶底时加入0.25%胰酶2mL37℃孵育5～10min，在显微镜下观察。当大部分细胞收缩变形后加入含15鸖的α-MEM培养液1mL终止消化，轻轻吹落细胞，1000r/min离心5min，细胞沉淀用含15鸖的α-MEM培养液混匀成单细胞悬液，按5.010 3 /cm2 重新接种于25cm 2 的培养瓶，此即第一代细胞（p 1 ）。当p 1 代MSC基本长满瓶底时加入0.25%胰酶消化下来，计数，分别将2月龄和5月龄鼠的细胞按1.0102 /cm 2 、1.010 3 /cm 2 的密度接种于六孔板，以后每隔一天换液，除去漂浮的死亡细胞后分别消化接种的2孔，并进行细胞计数，共12d。
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　　1.2.3 MSC鉴定当2月龄鼠的原代、第二代、第四代细胞基本长满瓶底时按上述方法消化，PBS液充分洗涤3次。细胞沉淀用PBS液混匀制成单细胞悬液，用300目尼龙网过滤后，1000r/min离心10min，吸掉上清加入PBS液300μL充分混匀，分装3管，每管100μL。分别加入CD 29 -FITC和CD 34 -PE;CD 45 -FITC;CD 90 -FITC抗体。于4℃孵育0.5h行流式细胞仪检测。1 S- V" A& W" U0 S1 f4 d$ E

　　2 结果
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　　2.1 MSC形态学变化原代细胞刚接种时呈圆形，细胞核位于中央，悬浮于培养液中。一般于接种后1～2h开始贴壁，24h后大部分细胞都贴壁。换液除去未贴壁的血细胞后可见部分贴壁细胞伸出多个突起，成梭形的成纤维细胞样或多角形改变，核位于细胞中央或边缘（图1A）。贴壁细胞以分散的克隆集落方式增殖，集落细胞增殖迅速，6～7d后成纤维细胞样或多角形改变更为明显（图1B），10d左右每个集落约含有100～200个细胞，细胞形态基本为均匀纺锤形的成纤维细胞样，偶有宽大扁平的多边形细胞，约12～14d时融合成单层（图1C）。传代细胞约0.5～1h就贴壁，24h内完全贴壁，细胞成宽大扁平的多边形，5～6d细胞达到完全融合，成均匀一致的纺锤形。

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　　图22月龄鼠MSC部分表面抗原的鉴定（略）5 f& E$ F( O& _/ X* _
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　　表1两种月龄鼠MSC的扩增结果 10（略）5 k: D, h0 Z1 u/ r, a8 A4 \
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2.2 两组大鼠MSC的扩增效应按1.010 3 /cm 2 接种的2月龄鼠的MSC在培养8d时，细胞平均扩增近17.4倍，5月龄鼠平均扩增近13倍;按1.010 2 /cm 2 接种的2月龄鼠的MSC在培养8d时，细胞平均扩增近10倍，5月龄鼠平均扩增6.8倍左右（表1）。3 t1 z* l# w+ _4 v; b
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　　2.3 表面抗原鉴定对2月龄鼠原代、第二、第四代MSC分别检测，原代细胞中CD 34 、CD45 表达率较高，经过传代后表达率接近零，呈阴性表达;CD 29 、CD 90 表达呈阳性，CD 29 的表达率随着细胞传代而逐渐升高，CD90 的表达率则逐渐下降（图2）。

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　　3 讨论

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　　MSC具有干细胞持续增殖和多向分化的特性，既经济又少有伦理上的争议，使其成为组织工程的首选种子细胞。但是骨髓中MSC的含量很少，约十万个骨髓单核细胞中只有一个MSC。因此要将MSC更好地应用于实验研究和临床，分离扩增MSC并了解其特性是很重要的前提条件。

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　　Friedenstein利用直接接种法将MSC从骨髓中分离出来［4］。由于骨髓中存在大量的悬浮细胞及其他易贴壁细胞，导致MSC贴壁细胞数下降，生长缓慢且不利于观察其生长过程。目前分离扩增MSC多采用将骨髓细胞溶液叠加于Ficoll-Paque淋巴细胞分离液上进行密度梯度离心，取中间的单核细胞层接种于塑料培养皿上，加入含FBS的培养液进行培养，这样培养的细胞贴壁快，呈集落样生长，细胞呈均匀一致的纺锤形。本实验结果显示选用α-MEM培养液，FBS的浓度控制在15%左右，细胞生长繁殖较好。同时向培养液中加入青霉素、链霉素，可以预防细菌感染。培养时每天观察细胞形态的变化，根据细胞的生长情况及培养液的颜色变化进行换液，一般3～4d换一次液。从生物学的一般规律来说，每种细胞体都应有一定寿命期，因此推测其分化增殖活性或许与细胞的寿命有联系。实验结果显示2月龄鼠MSC在接种密度1.010 2 /cm2 、1.010 3 /cm 2 时扩增率明显高于5月龄鼠的MSC，这就为选择适合月龄的鼠提取骨髓干细胞进行研究提供了依据。推测可能是5月龄鼠机体诱导MSC产生的激素减少;而月龄太小的大鼠骨髓腔中含有的骨髓量又较少，因此选择2月龄鼠培养MSC，细胞生长快，且细胞多。+ {  q$ N0 S2 @) O
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　　MSC表达间质细胞、内皮细胞、表皮细胞等多种细胞的表面标志。一般认为CD 29 、CD 90 、CD 71 、CD 44 、CD 105 、CD 106 等是MSC的重要表面标志物。由于MSC属于非造血类细胞，所以造血类细胞表面抗原如CD 34 、CD45 、CD 11b 、CD 14 等表达阴性［1，5］。国外较多文献报道，对MSC的鉴定主要选择CD 34 、CD 45 等阴性指标和CD29 、CD 90 、CD71 等阳性指标，但少见动态观察报告［6-8］。本实验结果显示原代细胞中CD 34 、CD 45 等表达率较高，经过传代后其表达率接近于零，呈阴性表达;CD 29 、CD 90 等表达呈阳性，且CD 29 的表达率随着细胞传代而逐渐升高，而CD 90 的表达率则逐渐下降。

　　CD 45 又称白细胞共同抗原（LCA），属跨膜糖蛋白家族成员，具有PTPase活性，在白细胞表达。本观察中该标志由原代的33.7%渐降至第四代的0.19%，可能反映了原代干细胞中混合了较多造血系干细胞，经传代淘汰后造血系干细胞逐渐减少。

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　　CD 34 亦属跨膜糖蛋白，一直被认为是造血系的始祖细胞或干细胞的表面抗原标志，其阳性率降低的解释也可能与CD 45 类似。3 e; ]3 W# H: x5 _/ t

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　　CD 29 由原代的51.5%阳性率到第四代后上升为95.9%，推测这种变化的原因之一是由于原代细胞的纯度不高，经过传代细胞逐渐被纯化后，MSC在总的细胞中所占的比例逐渐升高所致。另一种可能是CD 29 属整合素家族中的很迟出现的抗原（VLA）亚家族或称β 1 亚家族，该家族至少包括6个不同的成员（VLA 1-6 ），它们可在各种类型的细胞表面表达。在成熟细胞，由于此家族成员在丝裂原或同种异体抗原激活T细胞2～4周后才出现，故称为很迟出现的抗原，该机制对CD 29 表达率的动态变化是否起一定作用仍待证实。; G" h( q8 |# Q7 F% j' u
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　　CD 90 又称Thy-1，在成熟细胞为一种糖基磷脂酰肌醇锚着表面糖蛋白，主要在脑与淋巴组织表达。在笔者的动态观察中，该标志虽然表达阳性，但随着细胞的传代其阳性率呈下降趋势，其机制不明，需有进一步针对性的实验设计来探讨。0 A9 o4 F$ g/ }, x* |3 x

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　　综上所述，大鼠MSC的取材可能要考虑月龄，在MSC培养扩增的过程中其表面抗原标志会发生变化，这些变化可能表示了细胞纯度的改变或其他目前尚未证实的意义，这在应用MSC进行各种研究时可能会对实验结果的解读有参考意义。7 _: X" G( R. d7 h
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　　（图1见封二）（略）

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      【参考文献】) j+ u2 A& ^- Q, G6 p6 S
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　　［2］ Brazelton TR，Rossi FM，Keshet GI，et al.From marrow to brain:expression of neuronal phenotypes in adult mice［J］.Science，2000，290（5497）:1775-1779.
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　　［3］ Mezey E，Chandross KJ，Harta G，et al.Turning blood into brain:expression of neuronal phenotypes in adult mice［J］.Science，2000，290（5397）:1779-1782.( l, J/ O% R& B9 \/ S
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+ {) q  w( z, v6 M& S
　　［4］ Friedenstein AJ，Deriglasova UF，Kulagina NN，et al.Precur-sors for fibroblasts in different to populations of hematopoietic cells as detected by in vitro colony assay method［J］.Exp Hematol，1974，2（2）:83-92.) h6 L1 N4 j8 h4 N) z
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　　［5］ Sekiya I，Larson BL，Smith JR，et al.Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma:conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality［J］.Stem Cells，2002，20（6）:530-541.2 M" |8 ~$ e& z7 i7 l

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　　［6］ Lee HS，Huang GT，Chiang H，et al.Multipotential mes-enchyml stem cells from femoral bone marrow near the site of osteonecrosis［J］.Stem Cells，2003，21（2）:190-199.8 }! M* z8 D: J4 @+ R9 v4 [* E

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　　［7］ Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，etal.Adult rat and hu-man bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］.J Neurosci Res，2000，61（4）364-370.
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　　［8］ Cesare C，Irene AG，Salesh K，et al.Identification of mes-enchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood，liver，and bone marrow［J］.Blood，2001，98（8）:2396-2402

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