整封原位杂交探针制备步骤及原理

hualin840518

荧光原位杂交及其探针& C& a! _) \! z7 b
1、荧光原位杂交的原理
0 ^: F% [- N# F4 @1 I染色体荧光原位杂交始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，这种结合开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。其基础是Southern blot原理，以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体将半抗原显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。FISH具有快速灵敏、特异性好的特点，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。 9 g: x- W4 B" h$ k- t

1 {- g# Q* m$ B  {" H
' n5 x9 E# B9 j# E  I# d2 Q% \  z3 U2、荧光原位杂交探针的类型" @" ~, @  ?- _& h
FISH技术种类甚多，发展迅速，其实现需要获得能与靶序列互补结合的探针。常用的探针有以下三类：1、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星 DNA重复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异常，同时由于G显带时，端粒区是苍白的，因此涉及此区的易位常难以检测，而应用端粒探针则弥补了G显带的不足；2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检测染色体数目或结构异常；3、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）、P1人工染色体（P1 artificial chromosome, PAC）探针，主要用以识别染色体的易位、缺失和扩增。
3 G9 s) p) w. ?' ]' D/ c0 Sα-卫星DNA（alpha satellite DNA）是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着丝粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的单体为单位组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝粒DNA区域，其杂交将产生很强的杂交信号。因此常被选为着丝粒探针的来源。
' d' ?! |7 C+ z1 G6 D: l( l 5 K7 J" \* {) U  M
. r% h8 w; d8 z
The Wellcome Trust Sanger Institute（Hinxton, Cambridge）由Wellcome Trust和British Medical Research Council联合建立，是世界上较早开展人类基因组大规模测序并具有相当实力的测序中心。该中心利用能容纳大片段人类基因组DNA的高容量载体（如粘粒、BAC、PAC等）构建了大片段人类基因组DNA文库，通过文库中末端相互重叠的DNA片段连接成叠连群（contig）并与鸟枪法相结合，加快了基因组测序，实现了人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）中人类基因组的物理作图（physical mapping）和基因组测序相结合的目标。因此，这些克隆文库为基因定位研究提供了丰富的DNA 序列资源，NCBI Clone Registry（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/clone/）、Ensembl Genome Browser
/ m) W7 d$ P- t3 \( L7 ^$ K  q（http://www.ensembl.org/index.html）和UCSC Genome Bioinformatics（http://genome.ucsc.edu/）提供的网络生物信息学资源也记载了许多克隆基因组定位的详细信息，为我们选择相应克隆为作为染色体单一序列和端粒探针的来源提供了便利。
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9 e! {$ O# D* G' q荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交
- ?8 [1 Q' B9 o4 x) G: m8 ]& u
  V" {, l" K5 }( d: f. l! x实验流程 9 W# A1 g# `+ S& ?  Z3 Z
% t7 n1 s  a' ~$ P+ z5 [5 ^. {
第一天$ f& ?5 r. W# J7 l' I: F7 z
缺口平移标记探针
) ?" E/ b. `. I1.1 试剂准备
* |  ~" {6 K5 v+ F+ [0 C/ ?, @- j5 ]（1） 0.1mmol/L dNTP
$ ~9 K; H( ?8 ?0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。
* o" A% r3 p6 [* _, ~% I) t（2） 0.1mmol/L dTTP
$ c7 u* G/ x* Q+ [8 P1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。
4 k) [* B4 T% [; G/ k4 E5 z1.2 缺口平移体系和反应条件% u' A* L6 M9 h$ D
0.1mmol/L dTTP 6.5μl
+ m: w1 s4 }" a4 T" A( n' `0.1mmol/L dNTP 10μl% f6 |3 d( n# @' Z# S
10× Nick Translation buffer 5μl& F/ C* o5 \% b* i" I& R1 c
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl% c2 J; J4 s4 ?; w+ P2 V" x
Nick Translation Enzyme 10μl
  q( n6 R- ^; S0 cDNA (1μg) X μl, o$ k) T. G5 |: I4 B
H2O 18-X μl) g, C$ x/ g$ v! Q
in total 50μl) o, ~; E, }. t6 \$ F% T
以上为标记1μg DNA的缺口平移体系，若标记更多量的DNA，则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒，于15℃ 反应3.5小时；对于BAC/PAC，于15℃ 反应9小时。
/ v/ `4 q, J5 ~: a2 x, Q1.3 凝胶电泳判断探针大小
9 Q6 U* I& Q2 K% L/ r将EP管置于冰上，取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 ％琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小，单一序列探针合适大小为200～600bp；如片段大小偏大，则于15℃延长反应10～30分钟，再重复进行凝胶电泳，直至得到合适大小的探针。8 k. `4 e  ?7 {$ f4 q
1.4 终止反应
, p- Q* d; A" L# i0 h3 M) q6 J向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和（或）70℃加热5分钟，以灭活酶。探针于-20℃保存备用。
* [9 c5 D  \1 s6 S" c
: _( H4 f5 _) M第二天. X5 n: S' m; Z8 L7 o' l, o$ w
1. 探针的沉淀和变性3 ^& F+ U( o+ |& Y" @# ^% f
1.1 探针混合物的组成
" u/ f* P1 ]" J（1） 对BAC/PAC探针
( ?( b/ n  o) S( @9 u* v( tDNA探针 5ul
* R" g/ r( `8 u; \$ ^9 O3 a6 n+ WHuman Cot-1 DNA 3ul
8 q. H+ {0 x2 @8 l" BSalmon Sperm DNA 0.5ul
& m/ ]. D9 H% K2 {: nH2O 1.5ul
0 l4 N0 [0 V* T* W1 l  i  G3 oin total 10ul+ n8 F: {0 T% y! M0 z( Q3 n
（2） 对着丝粒探针：
# [3 V7 U0 @" j  RDNA探针 5ul% j3 P* M# \9 E2 P+ L% k
Salmon Sperm DNA 0.5ul5 f/ K$ j7 t5 w. F- U$ q2 u
H2O 4.5ul, l& K0 c; g; j- U( H9 l: }- `
in total 10ul; l! g+ |* J# r4 Y2 `5 v
1.2 DNA的沉淀! Y6 [/ y& ^" ^; Y6 E
将探针混合物与1ul（V/10）3M 醋酸钠（PH5.2）和27.5ul（2.5V）无水乙醇（-20℃冻存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀过夜），以14000g在4℃离心30min，以沉淀DNA。8 G8 M' u6 O$ J* o/ W
1.3 清洗沉淀
" X7 J! N5 |- R7 g: y小心弃去上清，用70 ％乙醇洗涤一次，再次以14000g在4℃离心15min；小心弃去上清，在45～50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10～15min。
" h/ ~0 d4 c/ _4 M8 ~注：当大部分乙醇蒸发时，白色的DNA沉淀变为半透明状；一定要彻底清除乙醇，否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀，导致高背景。2 C! o* ?  G- u9 P# ?3 k' Y' e# H
1.4 溶解探针
* V" E+ Z4 I1 H/ W* N加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺（PH 7.0），短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA；再加入预热至37℃的Master Mix 5μl，短时离心后在37℃振摇15～30min。3 W7 n1 |% Z' l% K- q
注：振摇时间尽可能延长；DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释，混匀后瞬时离心，37℃振摇15～30min。
' Y8 T! _1 X' Y9 A1 X. P& D1.5 探针的变性和预杂交
2 {% |1 S. D. W/ P短时离心后于80℃水浴中变性探针10min，冰浴5分钟；短时离心，于37℃水浴中预杂交30～60min；独特序列探针（如cDNA）和重复序列探针（如α-卫星DNA）探针，无需预杂交。! h& R6 b7 N: J% c' d
2. 标本（染色体靶DNA）的处理和变性5 l8 N5 N$ T( i. p% c% q9 \0 {: A
2.1 滴片和老化
7 b( p& \, E3 o2 _* R- e! A8 T取出储存于-20℃的细胞悬液标本，以1100 rpm.离心10min沉淀细胞，换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇（v/v）＝3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度，滴片，划出杂交区域，晾干；在预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min（也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟）；依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水，每缸2min，晾干（以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”）。9 R# ?& u5 ], O& E: \4 ^
2.2 RNase A消化
8 R! y' V3 k) k每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶（将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍），盖上22×22mm盖玻片，置于37℃湿盒中孵育1小时；室温下2×SSC中振荡洗涤，5min/次×3次；梯度乙醇脱水后凉干。3 P, p% `+ }( J6 [
2.3 靶DNA的变性' h: n& a% o; G8 w; B3 l( z
将玻片放入预温至72℃（每增加一张玻片，温度要提高1℃）的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后，立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。
& P5 j' R& n8 E) C/ x# L2.4 蛋白酶消化
: I. V; R; B7 b将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶（终浓度为0.01 ％）加入预温至37℃的50ml蒸馏水（PH 2.0，以适量稀盐酸酸化）中，混匀；将变性后的玻片放入其中处理10分钟；室温下1×PBS中振荡洗涤，5min/次×2次；室温下梯度乙醇脱水后凉干。
+ N) l& E+ O$ n/ Q! d注：靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行，完成后尽快进行杂交。
2 I; }/ Z; F9 x' @2 F3 x3. 杂交. I& b4 h3 ~0 {7 L, c
将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，封片后置于湿盒中，37℃杂交过夜。
. A3 C( L. {9 v! G) l) `$ L: \
, H8 V/ V* f6 X5 C- z% ]第三天
# h3 D8 H/ X! E5 E1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大
( z( Q$ ~& ]7 w1.1 杂交后洗片
! u+ R) u9 j3 a0 a小心揭去封片胶和盖玻片，将玻片置于预热至46℃的50 ％甲酰胺/2×SSC中，5min×3缸；将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸；每张玻片滴加30 μl阻断液1，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育30min；再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
- Q+ V; ]! \5 b" p+ a$ f注：此后步骤应注意避光操作。: [4 Z" _, V8 p* u6 y' {# S0 j$ {
1.2 滴加一抗; b$ M/ h; m- ?
将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中，混匀；每张玻片滴加25 μl 于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育1小时；室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。- t/ A( f/ R+ z9 x& r2 w
1.3 滴加二抗
; l, c2 r' @: Q. o) g$ n将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中，混匀；每张玻片滴加25 μl 于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育40min；室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
7 `% d8 H8 d: e( R: L1.4 滴加三抗* |- y: {6 W0 ?" r/ s3 L
将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中，混匀；每张玻片滴加25 μl 于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育30min；室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
3 }1 j) D* s* S1 J( S注：以上步骤按双色FISH描述，若为单色FISH则选择相应抗体即可。
/ D2 d+ [) ^2 N  g2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片
* n4 Y) O! i# o4 c9 E将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中（终浓度为125 ng/ml，避光保存于4℃），混匀；将玻片置于其中，避光复染2min；2×SSC中洗涤5min；梯度乙醇脱水晾干；每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片，盖上22mm×22mm盖玻片，-20℃避光保存。
; w: O- T) g3 O8 a0 v2 K3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号
8 Q- |% K1 X3 s  F) j- Q4 h- E% M$ O, U( D以荧光显微镜观察，在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号，计数细胞和采集图像。每例分析100～200个间期细胞核细胞，重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH，细胞内杂交信号相互靠近（<1/10核直径的距离）者计为一个信号。4 W; \& M- n5 @" T' j$ Y, q1 ^
4. 储存数据
8 Q) V5 Z* o1 ?' M* _/ M+ _