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首先讲解一下处死兔子后取骨髓的方法
+ Y1 `6 R! I, k1 Q# G g: _步骤如下:
+ h' o, T5 w* @9 ?一: 2周龄新西兰大耳白兔一只,空气栓塞处死,75%酒精浸泡10min(全部浸没);6 a7 [ k6 x7 d( b% j0 k
二: 带无菌手套,实验室空地方铺无菌巾一张,将兔子放在无菌巾上,用钳子,镊子,剪刀等分离出完整的股骨,胫骨,剔除骨表面的肌肉,表面组织尽量少为好,将分离好以后得骨放置在无菌的培养皿中,转移至超净工作台内(预先紫外照射30min);
$ \/ e* U( e9 L+ h3 o# ^& i3 C三: 准备三个无菌培养皿(我用的是9cm),每个中加入15mlPBS液,将骨分别依次在三个培养皿中清洗以除去骨表面碎屑组织;
' P2 b6 N7 D4 z8 P, y四: 用剪刀剪断股骨,胫骨骨的干骺端,两断都剪断,但不要剪的太多,尽量保留干骺端,能够冲洗,抽吸骨髓即可,然后用10ml注射器取无菌的PBS液10ml,冲洗骨髓至另外的无菌培养皿中,PBS液用量为20ml,反复冲洗,直到骨髓腔变白,干骺端也变白(我觉得骨髓间充质干细胞主要在干骺端)。始终保证总量为20ml,因为分装至15ml离心管中的时候不能太满,容易污染。
9 I( n# K; ]+ i% V五: 将收集的骨髓过滤,我的滤网为70um,购买自BD公司的(找的代理商买的,貌似16块钱一个,一次卖的是50个),过滤到无菌培养皿中,然后转移至两支15ml离心管中,离心,1500rbp,5min,弃上清,15%培养基(FBS 15ml,双抗1ml,低糖DMEM液85ml,FBS,DMEM液购自GIBCO)6ml重悬细胞,重悬的次数大概为100次(个人觉得次数多了可以将细胞冲散,有利于细胞的贴壁),然后分装至T25培养瓶中,两瓶,每瓶3ml,然后再每瓶加培养基2ml,一共5ml,做好标记,放置培养箱中培养。
' W3 w( ]% i6 g z) S$ H六: 5天以后第一次观察,期间不要换液,不要观察,一般好的培养基5天后可以见到部分细胞贴壁,此时全量换液,然后2~3天换液一次,基本上10天左右可以传代。6 b; e. R, q* w/ |
七: 同理取另外胫骨,股骨。
% F. T( l( _( N! d: o1 W$ r实验所需要准备的器材" D, t( b8 T$ T5 ]9 W4 ]
一 超净工作台之外,5ml注射器一个,无菌巾一张,无菌手套一副,75%酒精若干,烧杯一个,Timer,消毒好的剪刀,镊子,钳子等分离的器材,9cm无菌的玻璃培养皿(推荐玻璃的,可以重复利用)一个;
0 |4 r, Y& z, v' O6 m! ~5 k8 I4 Y二 超净工作台之内,10ml注射器若干,一次性手套一副,无菌培养皿5个,滤网一个,剪刀一把,镊子或钳子一把,15ml离心管4支,PBS液若干,培养基若干,培养瓶4个,吸管若干,记号笔一只。
, u& J9 K4 Y; ` u只记得这些了,要是忘记了大家可以补充的。 |
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