兔骨髓间充质干细胞的提取

267318024

首先讲解一下处死兔子后取骨髓的方法
9 _, U; Y% P; `0 b: G' ]& S/ M2 k步骤如下：
0 j$ Y* {: L8 g4 M一: 2周龄新西兰大耳白兔一只，空气栓塞处死，75%酒精浸泡10min（全部浸没）；
6 O: O! n5 X1 A6 a二: 带无菌手套，实验室空地方铺无菌巾一张，将兔子放在无菌巾上，用钳子，镊子，剪刀等分离出完整的股骨，胫骨，剔除骨表面的肌肉，表面组织尽量少为好，将分离好以后得骨放置在无菌的培养皿中，转移至超净工作台内（预先紫外照射30min）；2 T( Z9 o5 H, Y7 x9 T# q  D
三: 准备三个无菌培养皿（我用的是9cm），每个中加入15mlPBS液，将骨分别依次在三个培养皿中清洗以除去骨表面碎屑组织；
5 G) d! m2 p- s' a4 q+ q+ A四: 用剪刀剪断股骨，胫骨骨的干骺端，两断都剪断，但不要剪的太多，尽量保留干骺端，能够冲洗，抽吸骨髓即可，然后用10ml注射器取无菌的PBS液10ml，冲洗骨髓至另外的无菌培养皿中，PBS液用量为20ml，反复冲洗，直到骨髓腔变白，干骺端也变白（我觉得骨髓间充质干细胞主要在干骺端）。始终保证总量为20ml，因为分装至15ml离心管中的时候不能太满，容易污染。" K% G" A' D4 r' u& l/ g
五: 将收集的骨髓过滤，我的滤网为70um，购买自BD公司的（找的代理商买的，貌似16块钱一个，一次卖的是50个），过滤到无菌培养皿中，然后转移至两支15ml离心管中，离心，1500rbp，5min，弃上清，15%培养基（FBS 15ml，双抗1ml，低糖DMEM液85ml，FBS，DMEM液购自GIBCO）6ml重悬细胞，重悬的次数大概为100次（个人觉得次数多了可以将细胞冲散，有利于细胞的贴壁），然后分装至T25培养瓶中，两瓶，每瓶3ml，然后再每瓶加培养基2ml，一共5ml，做好标记，放置培养箱中培养。
$ f% z7 z$ i7 L* i- ]六: 5天以后第一次观察，期间不要换液，不要观察，一般好的培养基5天后可以见到部分细胞贴壁，此时全量换液，然后2~3天换液一次，基本上10天左右可以传代。8 u, }( i" J! r& s7 y/ B+ ~! B4 H/ a
七: 同理取另外胫骨，股骨。) v# L, c/ f" q! ^6 N% q
实验所需要准备的器材
& f2 c0 ?' e- J5 y一 超净工作台之外，5ml注射器一个，无菌巾一张，无菌手套一副，75%酒精若干，烧杯一个，Timer，消毒好的剪刀，镊子，钳子等分离的器材，9cm无菌的玻璃培养皿（推荐玻璃的，可以重复利用）一个；- Q/ K9 n& Y9 _$ }
二 超净工作台之内，10ml注射器若干，一次性手套一副，无菌培养皿5个，滤网一个，剪刀一把，镊子或钳子一把，15ml离心管4支，PBS液若干，培养基若干，培养瓶4个，吸管若干，记号笔一只。
! |! f" b9 ~* h只记得这些了，要是忘记了大家可以补充的。

267318024

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, X$ W: a# v; W$ R+ V
- [8 l3 g) j3 v; j活体取兔骨髓间充质干细胞方法0 f- c$ y. \6 D7 K+ W' e5 }
我活体用的兔子是一个月大的，确切的说是28天的兔子，方法如下
& T5 S$ J0 G* l! g    称重后麻醉，1%戊巴比妥钠，文献上面说3ml/kg，具体的就靠自己把握了，麻倒为止，备皮，剪掉胫骨，股骨处的兔毛，然后1%活力碘消毒消毒，铺洞巾；
' _6 I: `2 O( N4 i; x# d* X' m& J    刀片划开一个小口 长约1cm，与胫骨中断处，然后穿刺针，或者电钻（我们用的是电钻）钻开一个小孔，反复抽吸骨髓，具体的量 实在不不好把握，能多抽点就多抽点吧，不要用PBS液冲洗，抽吸后用棉球堵住孔，再抽吸的时候再把棉球拿开，以免造成不必要的出血，抽吸的骨髓装在预先装有1ml（含有肝素3000-4000U）肝素的离心管中，不用肝素也可以，但是速度要快，个人觉得还是用肝素的好，过滤，离心，跟上面的步骤一样的了。

林达

呵呵，学到了，很厉害哦，大侠们现在培养细胞已经是如火纯清的阶段了吧。。。可以教教我吗，我取了3次了，每次都失败，好烦哦，没有细胞源，做不了实验。。。

xiao6tao

我觉得如果很熟练的话就直接处死小兔。如果动作很慢的话，或者方法技巧不到位的话，建议麻醉。因为处死后，在慢慢提肉，会影响以后细胞的干性

林达

那个，用筛网过滤这个步骤是必须的吗请问，可不可以改用纱布过滤啊，我们实验室的筛网已经锈穿了。。。或者，可不可以省去过滤这个步骤啊，请问过滤的目的是什么啊，各位大侠，谢谢解答，辛苦咯

267318024

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# f& s2 I- g. Q
! x; P0 x; _! \7 d# e; M因为收集到的骨髓是成团的，过滤的目的是为了使其成为单个的细胞，要是不想过滤的话也可以，离心后多重悬一下，应该也是可以达到目的的。