骨髓干细胞就鉴定 有图

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软骨出来了，可是骨髓基质干细胞长的还不行，现在我都不知道是不是干细胞了。让我一个做成骨细胞的师姐看了一下她说是成骨，让做软骨的师兄看他说是软骨。搞得我都很晕了。希望大侠们指点。现在简单把我的整个过程跟大家说一遍，有什么不足的请指正。  }8 v3 J  L% Q- B& J
  1.取160-180g的SD大鼠一只，用3%戊巴比妥钠1.5ml（致死量）麻醉，拨皮，手术器械取下整个下肢，需要软骨的话注意不要把股骨头关节面破坏了。75%酒精泡15分钟移入超净台。; }+ n" m% ^$ ?8 t+ {
  2。用pbs漂洗两遍以上，在一次性培养皿中剃掉多余的软组织，剃的越干净越好。+ K+ L0 `+ ^  ~7 p2 i8 ^, r( [+ H9 n
  3，移入另一个培养皿，倒上点pbs，用手术刀削下股骨头上的软骨，注意不要削到软骨下骨，还有把半月板也取下来，剪碎。收集到离心管中胰蛋白酶37度摇床中消化10分钟后弃上清，加入二型胶原酶在培养箱中消化，分别于24h和48h分两批收集软骨细胞。（如果补需要软骨的战友们可不用这一步）& J/ X3 O2 J& w' I9 z& i
  4，用止血钳固定已经分离好的股骨和胫骨，用咬骨钳要掉两端。此时需要一个新的培养皿加入新鲜的α-MEM10ml左右，用10ml的注射器吸取培养液来冲洗骨髓到培养皿中，反复冲洗3次以上，剩下的骨头都这样处理，冲下来后在用吸管来充分吹打匀悬浮细胞。
2 t) m) P) q1 l, Z' K+ b  5，将混悬液移入培养瓶中放到培养箱中培养
$ t. @& V3 M9 [% J  6，前三天不去看它，也不要过多的打开培养箱; o% f& B4 N; d4 X  J# K
  7，第四天给予办换量换液3 }7 {3 ?, @' R5 y" E% K
  8，第五天全换量换液，并用pbs冲洗两遍，如果瓶底发现杂质较多可用吸管在瓶内吹打瓶底的杂质
7 R$ ]* R6 }" y; G' g0 D  9，接下来就是换液，看细胞的生长状态
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$ V& F" v6 V9 q& L, C% Y5 ^4 c5 [- v以上就是我的整个实验步骤，结果是我的细胞是长出来点了，可是瓶底的杂质较多，所以我每次换液的时候都要把pbs灌满培养瓶用吸管吹打瓶底，只要是贴住的细胞不会被吹下来的这可以放心，如果挂到就不敢保证了。可是那些杂质和细胞碎片很难被吹下来。所以我的细胞没有长成一大片而是散在的小团伙。
% z/ f  t6 L  J  我是5月20号做的，到今天拍的片子，请大家看看给我鉴定一下是不是干细胞，下一步该怎么办，是传代还是直接传到六孔板中爬片鉴定啊。

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大图为40倍镜下，小的为20倍镜下

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* u/ y3 V, u4 [; i1 J2 D
% G3 Y& z" i! |+ b4 e& O0 O! l补充内容 (2011-6-1 18:57):
: N8 p/ B5 n; s5 @* G请大家不要责怪，第一次用上图请原谅。拍图也是第一次拍，这两张也是20倍镜下图片。

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回复 皮搋子 的帖子
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因为全换液量的时候好多细胞，本人觉的是血细胞吧，它也不长，冲也冲不掉，就是圆圆的。冲掉的那些细胞就留下了小点点。那些就是杂质吧" L6 s  e4 c% j/ q6 `$ f

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回复 tangyvhuang 的帖子
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. o: m6 R" m8 j7 n我做的是先把干细胞养出来再诱导成软骨，所以如果它不是干细胞的话就诱导不出来了。那先养一养吧。等它长多了传一传代，留点本钱，第一次养出来。呵呵。。。谢了，以后向你请教哦
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回复 wenfeng8212 的帖子0 [- K; A, V# q

, }% o' y+ @' r4 |好的，也是这么考虑的，就怕它长不到那么多，有些细胞师姐说状态不怎么好了，伸展的不是那么大，开始有点回缩了。回缩了是说明这细胞的活力差了吧，只能再养养看了。谢谢了，请多指教

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回复 文武庙 的帖子% _" @  Q; P& G3 i
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可是我这一瓶就够做这么一次，传代会不会让细胞纯化一点啊。今天怎么听到我师姐说越传细胞越不纯，真有此现象吗

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回复 taxuewuge 的帖子2 k$ V' ]( [5 v. J( q5 L5 u
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好的，我做的就是原代的，步骤就是我说的那样，没有离心。再看看，不行那就重做了。我这次的问题是不是第一次换液的时间间隔有点长也有关系啊？两天就第一换液的话是不是就可以吧那些不贴壁的细胞冲的干净点，瓶底也干净点细胞好长？谢谢指导

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好的，希望它能长起来了，今天以看1号传代的软骨细胞长的真是疯狂啊，都长满了，我赶紧给冻存了，可是今天师姐感冒了不来科里，老板这两天都不在，不知道又上哪里旅游去了，只能自己来了。你冻存过么？有什么注意的地方跟小弟我说一下啊。谢了