又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

9 }# e  _; g  C) J; e- k. b' H3 A- G: M5 O& r7 c* X3 r3 {
在此省略实验试剂和仪器设备步骤  ?1 G9 }" u2 N; {
成纤维细胞的制备. b. ?# F/ e- K$ k/ {
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies0 L4 r) t% s% Q! F2 z" M8 Q  L' \
A 时间：15d
& o6 j( b. X2 a（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。" B& N" P+ z: m" V% S( M- V
（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
3 \$ Z# z8 |! a9 N（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min ) b5 X/ T5 Y' }* v% t
（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
9 P( d* a8 `$ v（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开- T% r# y, @$ W: T: ]
（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
* J+ G! `7 g+ [（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)! O, P2 E8 h" L; ^
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。# B5 s8 U1 i) `4 t/ G/ P3 |7 Q
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
' u; J. p0 M# f: z" `8 U3 z0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。$ `0 f) K3 k  v) g3 W
; q* J* T3 D5 y5 Q
尾尖（B）时间：10d6 J0 s2 ?- b5 f% G
在此略/ w" D; }, U" o: `8 n
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h4 r2 |, S  I' Z- |1 I, ~
（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中. O& d7 v# T- t+ N. F7 r
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
6 i1 [7 t" `; w# H8 R- H（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）) P0 V, K, {5 _- v2 [8 b; ^
（4）        160g 离心5 min，弃上清( {7 c. }( |3 I/ J  I1 O, b
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO21 O7 F! m6 E6 O0 z
孵育，直到达到80–90%汇合9 T7 \9 n8 _0 B/ L& u/ b  \

* _4 P, s: K/ c; o( _CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
2 V& z/ S9 ]' {. r, e  @- I+ {2 j% b, C0 }
SNL cells的传代 time：0.5h
/ U( {6 W% g* V) X6 C7 H% B! |（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次* u5 f# `# K1 H* m8 c
（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
# h6 B6 E  H% }（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞! U  \- i% ~% W! x! ^
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
+ _6 Y4 [2 }; }% y. F& i" d
' c$ T  D- U! f: ]. a0 ~Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h! X1 W6 m- T9 {8 X. T( `9 e
（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1" h1 P/ l" ]1 f: S
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。5 _, i4 t# f; @1 W
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min. ?, O6 y. Y: E/ a- E8 E
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
. [8 n3 ?# U( T! @& o7 L- `（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day., V" w+ S0 k* G, i, K. [- y/ o
PAUSE POINT
7 C4 k* L+ d, |: fThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
; f2 p6 L( g4 E# _* G  O5 {
7 |/ b  v# Z- J  [5 f) F解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）  ~% Z6 K  v! D! P4 r
（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中
4 m% A: m2 }! x8 j/ F& f1 I6 ?1 A（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）. w5 C0 [2 R3 j+ h! V& A" t
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）3 S  |; K: G; g4 f
（4）        160g 离心5 min，弃上清
( S1 _, U. `/ H9 I) a2 c) M（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育; z" K0 i0 C4 U. v( |! i% L( K
（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
' X- V3 I$ S- D
- S; O6 C; T4 ]Plat-E cells传代  TIMING  0.5h
! w# w( Y' i% s) K0 G（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清( N+ B  o$ N" |$ Q; U4 c8 H
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
& s, F: x7 B* k. YDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
  R% q, k$ C' F! R* q; L8 J（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
! z, `  i% j5 u4 B* R（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S* Y* ~4 i5 s/ l, ?3 Z
（3）        180g离心5min
/ l/ b4 e  O, t  f+ t6 E（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮0 a& y) _" s  z8 p2 U: W% L
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml) N0 j  T2 H- p5 d* ?1 Q9 r$ A. C
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
$ I1 Z1 X$ s  T+ jDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h8 r1 T5 v% m. b2 X5 x' G
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube* }* V8 t7 C, q! t
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min7 j4 }! F% c9 l* U( H
（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min* m& g) c- B8 L) Y- Q4 y
（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
& e$ z2 `, G7 A' `
6 ^9 e" n$ \+ G- {关键步骤, p* r( V, i  Q$ r$ d% a9 `
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
% W  O3 p5 g0 s3 C/ N7 G4 ]
$ z# C, {: H8 k+ [Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h8 N( S  T+ c- K! q- E& o' r
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
( Z+ K( W$ j9 n: QPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h+ p5 o7 y0 Y4 z5 M: R# _
（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）3 }3 H/ b. B. K+ {( S& Z' g
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗1 ^  p" }: F9 N- P) O  g
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
' A, p& l4 @* g; z" w（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中6 d& K4 w* o* X; y
（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。: A4 g4 G7 Q5 H4 Q2 ^
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h; b- K6 [; z# b
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。& n) [+ a* F; M$ A* A' S, M3 c! ~
（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
3 u% r; v8 [" @8 k$ P（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.! ]1 o7 L, }, R, _7 i
关键步骤& I0 Q! H2 Y( S+ x1 `
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度1 L8 D( L* ~% ]% W) |7 R5 m

; N8 Z% x2 D3 `+ z% `# X+ A（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
! i" A1 Z9 `9 W! d& S3 O
9 S/ \- v6 D; y8 c" ~: E5 _+ }; E1 ^Day 5 and 6  TIMING  5 min each day0 V9 ]+ O: ?& @$ S4 y+ O$ u$ _
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS/ _) o0 N( p$ K* I! C1 a* G1 x
Day 7   TIMING  5 min
7 C- T1 h+ B+ w6 {弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418- F4 T+ k( y3 y8 e0 ^# M1 {
Day 8–10   TIMING 5 min each day
% w0 A* G$ K, ^, x每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
7 P3 q4 m, Y( ?. f9 fDay 11   TIMING 5 min
$ p2 j" A: \0 {9 n2 V) a% _% ^7 B. b For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1" W& N8 S, I4 h4 f2 O
Day 12   TIMING 约5 min each day9 V0 F  N7 Y% t- w/ i  D# h( {2 M
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）8 Z" l% Q1 _8 X& e7 b
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d
+ `) H4 F% R" Y6 j（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
: X9 D: V* D$ u5 S# J0 C: V（2）        Wash the dishes twice with water.
5 l) s0 c* ^& M, ]  z# w& G（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
3 s: u$ [2 e" ~5 x3 R$ |4 H（4）        Wash the dishes with water
" U: e3 G- d+ V0 h3 r, W（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.
  K  Z" J4 k( K8 ~" G0 {
3 A) Z5 e3 _+ [4 bExpansion of iPS cells  TIMING 1 h) ?0 S  e* |; h0 ?! ]4 C* e" ^
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞6 @& ]1 M0 p  P  t" E
（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min% e" k; L0 o3 w% u5 J2 t4 A
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
: Z! y3 s, r: s; u5 k（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）4 D3 f, c6 t8 o! |& L& X
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h
5 k2 P/ N% [, _（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗, Y/ B. r9 r: v. P5 N
（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
& s' X' D3 u/ ^( ^4 r（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
; i5 e5 J4 i. p0 x3 T# Y（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min# q3 U: n& a+ Z2 u6 @! H
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml7 [! Y$ ], f; g) f$ i
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
$ d' \" @) E, ]6 l% |（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
5 v6 V. J) N  W! K) ?( U% g（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
$ s# |# Z- z' y! k5 r! E: [PAUSE POINT7 T" G- K8 q1 {, V
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.! W* S" {3 h5 J% k

sunny2829

什么时候的呀？？6 U) s# w+ g6 {( h

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子2 G) T7 Y7 n# [5 |# I
: V+ K6 r. H2 [& [# w& a7 I+ H9 ~
这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子
" p% |, C) T: R
4 \( ?# C% e( h1 H9 O呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。% p1 o: b5 S% k5 B3 W: H$ \5 C
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？- y' x7 b7 N7 V4 t7 F
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
* C" n9 t- w2 m1 m( \7 i这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？# F7 d& U5 f, I' B5 F
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子! C8 t0 V: x, O
# E8 U8 W) I6 p: _# `
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是8 P% q5 D$ j0 r# }% J0 ~
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是6 d/ J- a  c! @: u8 q
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生1 c9 `! y8 F+ u8 t) O
最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子
- X* _0 ]/ P! K; N) O4 r* R% G& y7 F* Z) |7 s
太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子$ r$ [4 k" V4 J8 Q% s/ X; ^

0 W3 y: F: i6 p0 b没事，相互帮助嘛