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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑 : p X$ {6 a4 d/ k- m5 w% j* S8 M
) E* H% F: n9 f1 J% W6 `% ?% B
在此省略实验试剂和仪器设备步骤' i+ |# u0 d B: y% n
成纤维细胞的制备, w# d4 F6 t( N D/ f, l+ G
1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies# R' o* L, T' G2 c6 S6 m
A 时间：15d
* l3 E* o, e' n0 L（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
1 b7 ~* ]/ D0 g- A（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
# Z( n: ~( g) Q+ R/ @（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min 5 Z& N& ^0 V: V
（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
9 O, d/ g; v& D. t& i（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
8 ]* y- S' _" b# h" `" |3 b9 V; a（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
8 X- t+ o+ Q* o8 _3 h! \- }8 P（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)3 B4 e5 ?5 @& A6 @
（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。- w/ \0 p4 |1 _! H3 F
（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
0 n1 D0 `! c0 o- w7 `/ j0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。+ t: ?) L" e" Z
$ M/ m4 a8 `3 l8 I尾尖（B）时间：10d
: ?# a& A) c; s. G+ }1 e" p在此略( o" j5 d) o1 W) S% d
解冻 SNL cells TIMING 0.5 h% N1 M& a' a! v
（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中, B; V/ h! Q4 s8 ?8 j; T
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）" n+ A9 P8 k ^. O) k2 H
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）2 p. g1 A! u& A n. i* T; N
（4） 160g 离心5 min，弃上清/ Y! @4 f. v5 G
（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2. k, ? \: V: c, R4 h7 L8 \
孵育，直到达到80–90%汇合
8 `0 R' I/ T9 n5 N) L3 |1 l4 Q5 c/ @ C0 y$ ]- A: N
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
4 c2 W4 L# O, J
! t. U. }6 c4 w! h8 ^, p! dSNL cells的传代 time：0.5h
! l2 g# P5 f+ G+ T3 L（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次
) o K* N3 f% H2 v（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min0 i3 n5 o) T! A, q2 v$ ?# ?) u
（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞 z- A/ @! k$ u2 e, a! C
（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage# k' m8 j _* E4 c) P' ]
1 E1 I+ r7 R2 q. z5 s
Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h' a- q8 T! Q9 T# Y4 s! M; ?
（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1# |0 M& ]: B6 |4 e; G1 d0 }' u
（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
9 J( N" ^) I$ y# K5 l（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min4 x* H! _1 U3 S) V- P
（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
* m4 y: z3 A9 ^, h9 n8 \0 K（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
$ \) V1 J' t$ {( y$ X: iPAUSE POINT5 C, [6 P( ~7 o7 V4 M& U
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
$ @) c5 `; }& z+ Y0 Q
9 T; D: C6 D7 i2 h" ?! [& i解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）* `# X* o( T9 d: ~4 W) W0 ?
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中
) G! E' H; k4 J0 U! I' G（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
, j/ P4 c* ^7 j' S& P' S7 a# i" D（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）" }) ~" W8 C1 v3 C
（4） 160g 离心5 min，弃上清
* g5 n$ B* p6 f, R（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
# ]6 }$ J s$ W& ^: C0 d' z |（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
' T7 i4 O0 l& I6 w/ i% C7 a% l) K, L g5 R2 |8 \+ H3 k
Plat-E cells传代 TIMING 0.5h
3 Z# ~8 o) \6 c6 M/ D（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清$ g P1 }' `$ L) q1 ]
（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
/ }. T& v; H+ J; gDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h# j/ z7 s) c o* o' `% q% b
（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min$ Z8 q C: z/ d1 s
（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
0 q2 L1 [ C+ G9 W（3） 180g离心5min$ j4 X) [; I; `) p7 r0 R
（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
( y0 e+ E: o, r2 h5 m/ c3 f7 ~（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
4 b4 l% u+ |3 W9 b（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2- l- V. d- g3 C( i- @# Q
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h3 M/ T" @( s- h) k9 W4 c" }
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
6 l6 M. F4 |2 k: z3 D3 d$ k（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
" Z8 i# `0 B- m( j: F. J$ }! K（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
" ^8 p6 Z! ^9 \5 \- W（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜9 L/ F, d* \. K
/ @0 s3 W! `) I# U# d+ {
关键步骤6 q" `9 A* {) f/ f. a( Q
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction0 `+ H! N/ b" z( i- ~+ W) s
J& |5 _7 _3 B5 I* S8 YDay 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h& Y; D+ z2 I, ^( C+ V: r
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
; I, ]) f* v6 h0 kPreparation of fibroblasts TIMING 1 h" o; O- @ n! A: [ }% {& `
（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
+ ]4 J/ a( n' W/ {6 \. I（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗2 }/ M# A( y1 B) h5 {6 J- y& o
（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min* Q' s% t/ v' V1 |
（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中( P) I, X* \5 ^+ U: x) ~
（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
) e$ d0 u7 s' N+ k. n0 t% E7 c" SDay 4: retroviral infection TIMING 0.5 h9 E5 D6 h( c! f
（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
( ] k; e$ F, m4 v（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
) u3 N, X: F8 k7 W5 `（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.: ^! A6 b5 O' s; P' j8 {$ d; L
关键步骤
" c% o, X- U5 W& r, t3 l0 @Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度* R* ?% d( a; c+ Z% v# ^% A
R1 G5 a' G) D ^" {- z: {0 c" y（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜7 ^0 H9 z4 j1 d0 N
! c5 S- c9 L Z* ?* X7 QDay 5 and 6 TIMING 5 min each day
% {" m \& r6 i& c8 w( X, A24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS) P: i- y& b2 g- J! ?$ {( P) ^
Day 7 TIMING 5 min
" o$ g8 f8 C: P% o+ o/ m弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418/ }$ G& O' h3 o1 V2 |) K# T: j* T
Day 8–10 TIMING 5 min each day6 `' L: z+ d0 n
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）1 R. s+ W, J9 S0 M9 g; [" ]
Day 11 TIMING 5 min
% |' |% i9 v' D For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
: ^. v" S, Q+ _ e8 `) kDay 12 TIMING 约5 min each day
' n- G6 {, S: [' M2 Z: P每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）/ N7 S9 y. z! X0 K X* F
Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d
- o8 `. ^( S! B' n8 K: U1 j4 `! H4 \（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min5 K1 ^9 `6 N* k# E
（2） Wash the dishes twice with water.; h. @0 o/ m; @0 @$ |( `, p
（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
5 ^& {, J$ [% {4 ^) U" R（4） Wash the dishes with water
9 l1 [) p) l; j（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.
8 U. [# K1 c; o* B( D
& u. R3 T4 ]7 l. {) aExpansion of iPS cells TIMING 1 h
5 A/ l3 v4 I0 k4 g6 r7 L（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞/ {% Y. B4 y% Y) q" h. r- a. p
（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
" a- k. c5 _$ w9 H) O8 k5 O! p' a（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层- ~, ~* s5 q+ t" B8 h; J# T
（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）. p4 O- g/ _8 q( }8 p2 ~
Preparation of freeze stock TIMING 1 h
3 z. V( k/ d$ F/ ]& x: Q（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗3 l! b; m) V1 o- P2 z
（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
4 p" h/ l9 n4 h' L0 F8 N（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
' z' e: P. a1 {) m* T2 |+ I0 N（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
3 x! j9 E1 B! U, D \（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml- R0 A, y8 `. X/ M) ^( [2 a. x1 A( j
（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）( k; _: z4 n/ w5 ], n
（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
8 e- k& t9 A% o( h, L) p（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
) r/ ~/ c+ r6 E& @PAUSE POINT
0 B1 @7 l F) o( j; c- mFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank. i" D) U( {# H; ^4 Y( B% Q0 k
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发表于 2011-6-10 09:06
