|
- 积分
- 2917
- 威望
- 2917
- 包包
- 6530
|
 
本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑
# b) Z6 |' ?7 c5 y2 ]3 j3 I" B* {) g! x k
在此省略实验试剂和仪器设备步骤
; W( l! n; q, R/ Q L! x成纤维细胞的制备- Y9 I# N j7 I u
1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies
' F9 W5 V" T0 @) ^' I8 f$ gA 时间：15d, w3 W% a& M: A8 Y3 m8 C
（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。# S$ f3 t! A6 f- \2 Y- L
（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除( l i0 l; ]& O- _* e% P6 n# b
（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min 6 a6 s. J1 L9 r r; h
（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min & L: d& H) Y2 b3 V0 @
（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开& M3 @! O9 s. n& u$ Z5 G6 a
（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。8 W+ }4 U+ j/ G+ Y# G, e O
（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)0 X" [: g- I! ?5 i
（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
% h9 b" T- s1 ~) Q8 k6 |! l2 g（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and) g5 V# \" g4 N
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
. H) |& S5 c2 E+ i* n
- p; u: W/ ]( \" v5 ^* C尾尖（B）时间：10d3 F0 W4 f3 o2 M6 V7 b: K
在此略
8 x/ J6 i8 s7 \+ o解冻 SNL cells TIMING 0.5 h
6 g1 o5 g* s( J4 k' b（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
+ h+ Z5 _2 H* g3 I. y( h' W5 b4 |- |（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
) K3 n( p6 ?* L: s' }7 F' W（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
3 P% P3 V. }6 Q（4） 160g 离心5 min，弃上清% n+ A# _# _; i7 Q7 D+ Z% W1 o" p
（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2# a+ f" q/ h8 ?; ~- N. \2 w
孵育，直到达到80–90%汇合
, g" Y# y. [, ^4 E0 q$ K6 y: N M7 V
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
2 M7 u _$ l1 e# c5 M! _3 g) h) f, V
; e g: u! { i8 L/ P: s( a$ zSNL cells的传代 time：0.5h
, s/ A5 R$ e7 Y% h（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次, H- p, k0 B d5 i, o5 I
（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min6 P: s) h: ^- Y' [
（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
- O7 `$ q6 g1 F7 C+ m（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
& \" S {% b7 g1 l( O7 b& L' T. M4 D, m, ~* h3 @
Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h7 D8 b9 x# \# w" c
（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
$ n, I) V4 ^9 J) e# R$ S# G X（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
c) D- e" x; `9 W) I（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min. j3 L; @: w3 x, v. N; m
（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
3 y8 S2 C7 I$ A' t3 x$ S8 r（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.' w+ w) c. N# b: c6 @1 y
PAUSE POINT$ p; b" `, v; ?3 p8 @2 R! e6 i
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周2 I, b; s. @$ R) p! E4 g
. h9 X$ j* W1 D3 \9 I: _ k
解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）' U9 k- Y- E2 B
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中5 I1 p3 u; U+ N* k1 O2 I! s
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）8 f& s L4 E5 R# S* l4 E" U8 `
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
- A/ q; y0 z3 v7 m8 t5 C! G（4） 160g 离心5 min，弃上清. r9 f( }0 ~ o. u2 p2 f4 ]# p
（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
, t& a) h _# C（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合) d* q5 t t* @1 e
1 q$ `2 b# u3 y, F: `
Plat-E cells传代 TIMING 0.5h
* ~/ o# _9 M9 [2 g, h（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
% i7 p( r2 p; C( ^7 ^; u* k9 L（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
- t/ f( M: G7 `: P) \+ I% d7 `Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h
& Q% z' e' @0 f1 m* ?6 l（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
7 a- c/ C" U3 U8 E0 C5 e（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S; g, W/ W$ l8 ^- g9 {! x- v- |
（3） 180g离心5min
2 L7 L; s9 _* Q% ?- p4 {（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
5 }0 Q0 L9 R- o& K7 F2 T$ T（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml. h3 K& w G, E: n$ H1 h2 l6 S
（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2+ R% W9 `8 f! e: k$ M( d
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h- @2 m% B( S8 K5 i9 Y1 w; `, ^
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube; t9 q9 D }* s; t+ a
（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min5 i5 ^ @1 z: s4 ]9 P
（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
* I) F% y) F Q, p（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
6 s l1 j' D# O# x1 P/ d% Q4 r9 Y. k; x8 x8 M5 \0 ?
关键步骤
, n }3 H# O7 O7 m0 wAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
2 g+ @2 q) G- _5 I$ k1 e& Y5 `) g. F4 `- N( `9 }
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h
; f( Z4 Q6 ^9 `# r吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator: I' s& r6 j G7 m% p/ d; Y
Preparation of fibroblasts TIMING 1 h
0 g7 V& ^/ K/ `0 X& y* E（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
( t' \0 o9 H0 K$ E（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗2 O; v# t; ?$ |1 x: s5 [3 P! ?
（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
6 M! n/ V! \2 C, z, j（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中/ k, v2 ?2 R% o: {
（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。* z: ~. P3 S% C( K) ]2 _8 B) I
Day 4: retroviral infection TIMING 0.5 h3 w! v! b6 f' q$ h# {' {7 B
（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
2 T' B, H2 r( l7 i（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–10 }6 C6 x& g2 {5 |9 m6 N
（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.9 B0 L, r* L2 |) j- O; a
关键步骤
9 y; Y/ u; k+ Y8 eRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度4 { g$ ?" m3 H3 H
0 X ]) {5 J; y9 J（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜/ D4 y1 S' O; l$ u# f, a3 u
V5 w) i7 D+ N4 R j1 D
Day 5 and 6 TIMING 5 min each day
7 K: K0 h" z) e5 E5 y$ A24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS. W( [2 x5 P8 D4 {5 W
Day 7 TIMING 5 min5 Z- D/ i: Y8 F5 C1 w
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G4186 f: b7 f. L! R& g! Q. L2 u
Day 8–10 TIMING 5 min each day
- c. q2 I3 o+ v1 _9 u8 c每天更换培养基（分别在24,48,72h后）$ e( V" X' U: @
Day 11 TIMING 5 min
) v7 o1 R7 u I1 `. g. x6 _ For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
" O! n! p5 v. C/ L* i4 C- Z) uDay 12 TIMING 约5 min each day( u E5 y7 G" \8 a$ }2 e
每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）) F1 Y0 ?: C- C& L) P8 N
Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d
/ @# I: K& j; f（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min- ?! h4 w5 \1 L7 {: M0 }
（2） Wash the dishes twice with water.
& k4 ?6 `: t8 {（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
$ }8 j. u2 H# g O6 h（4） Wash the dishes with water
9 R6 V* j% O* q" W（5） Photograph the dishes and count the number of colonies./ ^- R# b/ }. q, i8 g
o5 n3 |) R2 i: v0 t3 B ~* j
Expansion of iPS cells TIMING 1 h
; ^) p, r+ o+ T; \9 A) p: R& S$ c（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞' O+ h3 K0 q5 t% i( {! |
（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min- G" x' Y% B. T6 w; O0 Y" e
（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层# N3 Z$ _/ ~- s& a, l
（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
7 o2 X$ s D" i6 ^" s: @Preparation of freeze stock TIMING 1 h
8 o& y1 a! B: d* M+ g" V（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗
" I/ m( n5 {$ w0 i, s（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min- {9 B1 c* L& d7 K7 N
（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层( c. q; _ l4 W+ N! v
（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min) k& g r: O# \4 D A# A' q
（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
4 w$ v$ S# c5 {% |, {+ D, K1 B（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
/ P7 T" o% |* ?4 M. ]# V（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
/ W; D- ~1 i/ [( J, u（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
" u4 z {2 j! F. S3 ]% k2 LPAUSE POINT
% a1 p# s. H, S. [! K+ ^- bFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank., Q0 X$ I* r. Y+ K/ e* l0 p
|
附件: 你需要登录才可以下载或查看附件。没有帐号？注册
-
总评分: 威望 + 50
包包 + 100
查看全部评分
|
发表于 2011-6-10 09:06
