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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑
% J! v+ S/ k% T
/ }0 X4 f1 }/ X4 Q' h# Y在此省略实验试剂和仪器设备步骤% y) f6 O' y. ]$ C. q6 F- s* g
成纤维细胞的制备
0 }3 d, c+ _: q2 n+ E, m: S1 S1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies$ a! }, G6 }2 z- P
A 时间：15d; X3 Q: }3 \- R& R! }3 L" G4 x
（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
/ N2 a' H% m& Z' X) ]* W4 r2 }# a* A（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除) M; T! U' O$ s
（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
6 H- }4 E7 j, Z（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min # E0 d+ a3 |% \0 Q/ Y6 Q+ k
（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
* K4 t i: a3 w" ^/ ?4 U（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
2 N* Y, b- w2 e4 i# E0 e8 O+ n" c1 u: k（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
2 H' B& h( h( r* B（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
1 h+ X' h) L! f6 Y. `! E5 j- \（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and; _$ O; m `+ D. k \# G$ G
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。4 {; s* p! O0 y- }
9 E! o) `0 C9 @! C/ Z( N- }4 e- M2 \尾尖（B）时间：10d
8 v' w+ h# l. D- `, x2 w在此略
1 i0 ?( F3 e/ c) N解冻 SNL cells TIMING 0.5 h
3 [$ I" l9 Y. S6 v9 L（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
7 b" x+ ^% f: j9 p（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
9 x6 R7 y1 u: g: |* v$ R（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）; V9 F) n* Q0 w+ L4 R9 k' }# k
（4） 160g 离心5 min，弃上清
& e( Q- b! f1 o. t* d2 Z（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
+ X. t" F9 ^ i+ d. ~6 l孵育，直到达到80–90%汇合
4 y1 l2 Z. _& N% C$ A: `/ R
3 I* x; d6 L5 B+ j }# \CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
3 N& y8 M4 _. \: y Z6 y! h* k2 K8 i2 }6 p# l
SNL cells的传代 time：0.5h+ I6 }" J7 S- q
（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次9 r- _" c6 j9 K0 w* K
（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min$ R( g4 O+ o' p/ [# |1 s( w
（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞. I4 p4 n- U2 k' \6 r9 e' b6 Q
（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
3 A- Y; }/ d, T4 y) |- P1 k6 k
% W) V; @4 H* B3 W$ Y' Q4 S, E: |Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h' b5 ~2 N7 v8 ]6 G/ G$ @" h
（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–15 E; y& ^+ e& Q% i, Q; @
（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。, }6 z/ Q0 Q; ~( g- ?8 ^
（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
. u1 Q: s5 u) S4 g（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
) \6 r @; S0 {6 l' M8 R9 S3 q（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
, Q' N) r u4 E4 h% G; ?0 i( B7 ^PAUSE POINT
7 | g1 ]7 I+ J7 z6 @7 j1 AThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周3 q6 y F3 p3 i! ~$ G' U3 ~
' _4 R L- {2 |; |, G) @& v2 n
解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）* U9 n2 Z: J/ [1 L$ H
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中
+ Q$ r6 c8 ^2 ?- q（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）: N: o7 ?6 W" n2 U% j
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）) m* C- q( T1 v8 ]3 F0 C
（4） 160g 离心5 min，弃上清
2 {6 T: K' E9 h9 J6 E' N- l（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
' ^ i, a. W9 h4 ^" h4 r（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
) c% b- O; a) E1 J* R: c8 x3 O! L8 B3 Q
Plat-E cells传代 TIMING 0.5h' N6 V) Q' P7 W" R/ d; r
（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清- C! Z& @/ p4 q
（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合" Y, L2 l" W' |" P+ o
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h( z4 b5 Y6 s) S s
（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
3 N, \3 Z; u) S" ]% d（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
% a' v" K9 e/ d" s6 `% D7 _（3） 180g离心5min0 C2 U9 a% f' N2 [. f w
（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮2 A# [ |( R& i* r$ e6 Z6 L
（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml' k5 D& {7 p" I9 b
（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
" f3 @/ d4 }7 e3 @' ^Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h) L# B4 h; `6 p5 U) X
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
- W7 R, j& j+ F1 y; |/ K! u（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min8 }. V* J! |. l) |
（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
# g! l0 P* P' \9 G4 @（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
: |/ H! D6 K1 ?' ]1 k) G9 W
0 s+ z7 i% J( d9 }) _& U X4 S关键步骤
: B* j' y0 L- N7 i& e6 Y# hAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
7 s9 c1 f5 m+ W2 w; B# Q& e# q8 f2 }+ t1 \- R
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h1 L) z s0 i( R4 r5 }
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
1 M, M; K ]3 I( l \ l# i6 EPreparation of fibroblasts TIMING 1 h
' v; x, s X+ w3 E- ^/ u（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）6 _0 f6 @6 F8 Z
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗1 j- |1 W! s, \+ w2 K
（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min2 v2 t6 K9 u$ Q3 o+ G. A. D$ f
（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
5 H: F. L9 t# h3 }/ T; t9 A（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。- g8 ~8 J; i& B* y
Day 4: retroviral infection TIMING 0.5 h4 J& e0 j! } I" z3 a
（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。4 u, o+ L0 W" f& k) s
（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
$ h* q1 l* d0 R（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.( v v( _% K. E* f8 X
关键步骤
1 ^% [) h0 Y9 @- w* {Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度+ @ n( h5 ]4 q& k) E
; S: _) m. {5 \9 l3 M
（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜* d- ^# V$ `" V- q" O6 S; B9 N4 t/ u
% `* C4 i: g1 K5 F; y* \" G! v, x" ^Day 5 and 6 TIMING 5 min each day! V! d* o8 J: P% s* G6 |
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
/ l3 l2 \: T$ e `Day 7 TIMING 5 min6 s, e9 p4 V' M1 ]7 I
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
. [; B6 I4 b0 c- H! X% XDay 8–10 TIMING 5 min each day
5 S; j/ G4 Y J& ]! u+ g0 s6 H! b每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
/ z3 U$ |" Q( U0 H' p! X% i/ ]Day 11 TIMING 5 min# Z! U. \1 l2 X7 o1 {4 x
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1, M" U. m; L. @+ f6 @& E1 ~$ G- h2 P
Day 12 TIMING 约5 min each day& z- J# ?7 ^8 h
每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
' y( L$ M" u8 l/ i$ rCounting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d
) J' }5 _% f' y1 J! w6 R. S" x: g0 D（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
6 e2 I; P3 _' V! D（2） Wash the dishes twice with water.% O N! F+ K5 G8 ~
（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
% B9 p0 L* A7 ?. `: @（4） Wash the dishes with water
# ?8 s, \/ g$ s( h. m+ b% E9 G6 ~& z（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.
6 c4 {: x6 s5 Q3 A4 y0 V
% Y" k( R# M0 jExpansion of iPS cells TIMING 1 h
8 v; a% U( f' W5 X) F（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞9 e+ ?, R( S( `$ {
（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
2 L* D: q/ H! s& w" H& R- Y（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
" i/ e" L3 N3 p7 X! q（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）4 B1 ^% u% {) [& l
Preparation of freeze stock TIMING 1 h i+ ~4 {, p+ e
（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗( x2 E3 @( `, W) u4 [& v- I; v4 P |
（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min3 K% G2 b4 V' D9 J) e2 Q Y6 H
（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层* s# D W$ z5 m. R1 e
（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
: J+ z/ X6 A; X5 ?: T5 d' ]（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml; z) M$ h& g- ]- I9 t' H
（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）3 {+ `, U8 m2 c! _7 k/ E
（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀/ h# P5 }9 o N4 H& u) b* Z0 ^$ S6 n/ {
（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
7 v+ d5 O6 `5 g7 KPAUSE POINT
. C8 ~2 r( u8 C2 m* {" r3 F$ ^- o2 a5 PFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
1 ]: |- n- e+ Y6 V |
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发表于 2011-6-10 09:06
