又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程） - ips专区干细胞之家



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huangcong1988

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发表于 2011-6-10 09:06 |只看该作者 |正序浏览 |打印

本帖最后由细胞海洋于 2014-10-24 09:51 编辑

在此省略实验试剂和仪器设备步骤# O" \$ k1 Y9 G* q0 n. ~3 a
成纤维细胞的制备# Y) F  ^% J8 d% [- q/ m4 F
1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies+ c( l. u* d4 r% U
A 时间：15d
（1）通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
（2）用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
（3）将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min 7 H$ N  Q4 E5 ]
（4）另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min * H6 V) k; B5 }+ F
（5）加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开3 n1 G4 t. m( S/ `3 i0 p
（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
（7）细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)0 g8 F6 q0 x% ?- I6 ~! S/ y
（8）第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
（9）当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and5 X0 o: M: D  K. k6 c! f
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。

尾尖（B）时间：10d
在此略+ W& g( x8 ^8 n  H) b
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h; Z4 F! v- I6 i" P3 v6 C! x5 t
（1）准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
（2）从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）! P2 l1 V: n5 Q! r* s0 t
（3）用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
（4） 160g 离心5 min，弃上清3 p- X; e1 u- q* h2 p' I: N
（5）用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO23 Q  M; c0 Y$ x: [" C
孵育，直到达到80–90%汇合! p7 c7 J' D5 F& _

CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。

SNL cells的传代 time：0.5h
（1）弃培养液，用PBS清洗细胞一次* f3 f) e& B' }
（2）吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min9 a/ {" N) x1 ~3 p: I* V
（3）加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
（4）通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage

Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h2 k% ?# O! ^. ^$ O7 j/ O
（1）直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it brieﬂy（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The ﬁnal concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1: z( ?8 h, Y" {( P0 ~" V
（2）孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。: R3 |* T6 x( I$ |+ Q. ]
（3）吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min' c1 M6 k  \2 G" x  Y  i* X- ^
（4）加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
（5）细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.5 {9 [9 J# B) o1 V
PAUSE POINT
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周: ?  U$ Y! V( a

解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
（1）准备9ml的FP medium于15ml的tube中
（2）从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
（3）用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）) i4 x& X8 e/ H# r. Z* }. V7 L5 }
（4） 160g 离心5 min，弃上清4 ]3 @! ~; o" q+ V- K
（5）用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
（6）第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合$ x/ J& B* T+ {' Z# ]; Z( ?

Plat-E cells传代  TIMING  0.5h
（1）吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
（2）加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h& V- d8 ?( e: r. \8 ~: B
（1）用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
（2）之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S1 R; _& S1 t" r4 @! j% t
（3） 180g离心5min
（4）弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
（5）细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml+ t1 ^) r- E5 }. H
（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2& i* `. E( o8 u/ @8 Y
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h
（1）移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube! x4 P" H7 Y2 n1 d' a8 A
（2）在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min9 z4 X- o6 e+ K6 F& q
（3）加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
（4）逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
- E  [+ v0 U8 a6 g# z/ f' B3 e/ u
关键步骤
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efﬁciency。We routinely obtain efﬁciency ＞80%. High-efﬁcient transfection is crucial for iPS cell induction
" T- L; y  z5 m5 `+ Y" K$ \
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h4 J9 s/ B4 d1 t3 o! A
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator$ U) z# `6 q7 J3 U
Preparation of ﬁbroblasts  TIMING 1 h9 g! j* G) [4 H4 n0 N
（1）培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）1 z! q2 e- u. A: b& t# ^, q
（2）吸出培养基，用10ml的PBS清洗
（3）弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min; j* i* h3 a' o6 q9 b! U' V
（4）加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中- r3 @- O; K3 g- M; D' B
（5）细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。5 ?# ~/ i" J+ g- M$ {
Day 4: retroviral infection TIMING 0.5 h" ]; a* S' v1 q0 t
（1）用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
（2）加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml ﬁltrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The ﬁnal concentration of polybrene will be 4微g ml–10 ^& V, T% J& p& ]7 b
（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
关键步骤, c5 R+ n9 H9 o/ S) L
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度% v2 \4 l+ ]1 i) Y0 [+ {

（4）从ﬁbroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜

Day 5 and 6  TIMING  5 min each day; e" h2 w0 E& s" z  p0 [
24或者48h之后，从ﬁbroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS+ {1 |- g: P$ M; u; C& c
Day 7 TIMING  5 min
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418" X. @5 A0 d# q; ^8 ]: G
Day 8–10 TIMING 5 min each day
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
Day 11 TIMING 5 min
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the ﬁnal concentration of 1.5 mg ml–1  G$ j1 ?4 W; @- t7 L9 m
Day 12 TIMING 约5 min each day) @8 Z! C, k* ^& A
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should ﬁrst become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）6 v2 ~% J3 [; M8 U: d2 Y+ W
Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d
（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
（2） Wash the dishes twice with water.
（3）加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
（4） Wash the dishes with water
（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.

Expansion of iPS cells  TIMING 1 h
（1）弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
（2）彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
（3）加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层9 I0 k# u5 t2 C: T1 `% V
（4）将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
Preparation of freeze stock TIMING 1 h
（1）弃培养基，用2ml PBS清洗+ v. P* R3 h3 A7 u0 J% J( C
（2）彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
（3）加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
（4）将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min1 \+ M' e% s: R9 d
（5）弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml: {: }# E7 ]# I. R
（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）, L- x$ N' `9 D& F$ O" V
（7）加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀) C3 w8 F( \; Z) S
（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）! Q4 Q( o+ A3 }  }9 P. I
PAUSE POINT" X* }0 t2 u4 j. u: _! T% [2 B
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.8 A( @  }$ ]" s) p! w' X$ o

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