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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑
7 v. u: j$ t. {5 _
' R2 F, v' F1 |% ]在此省略实验试剂和仪器设备步骤
* a7 F* ^! Q! ~. ^7 F1 D成纤维细胞的制备
2 t1 O+ a9 H+ g& p3 @9 w5 C5 n6 ^1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies
: D' _% B5 w& Q7 F, o: QA 时间：15d9 B2 d# \: e& {& \; ]# j
（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
1 N% p: y' q! [/ s（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除- {( U" _( ^0 o; _* Y3 j! ]
（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
; x0 \- n" `5 i# r8 D, a- |$ `( s" P（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
, q7 \4 v) w+ ]; \+ _- s/ S) A( X（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
" j& d, @$ Z1 k6 S+ F（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。+ w( E# I9 g4 I3 @0 r3 x4 t" T
（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
+ {( H8 |6 H( `& v（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
( b1 D% W, V; x$ y5 m: Q) r（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
5 q- {$ @- q$ Y5 r6 \! l0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。2 X) v" }) B5 |
, h3 b1 `2 W& v7 R* _: j5 F
尾尖（B）时间：10d7 ^, j g# l% E
在此略5 E& v1 J- @& w; Z
解冻 SNL cells TIMING 0.5 h2 s# b2 w+ h$ a1 l; V( U
（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
2 X! P' ~4 L% z! t（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）, ]# r8 B: x4 ?8 a- h9 H
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）( [, k1 m0 Q4 M+ t- O, N
（4） 160g 离心5 min，弃上清- P* i3 A! `+ n$ G" {
（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
( `& ~- }, h! y' O: V孵育，直到达到80–90%汇合
& b) ^& b! t* E% x. ~4 S3 |* Z0 K9 Q m& @& U
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。+ n$ A2 h: y4 a- K" P$ }
" q0 O( A5 e# Z8 @SNL cells的传代 time：0.5h
& a. Z2 ~# l" U! n& Q5 W（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次
/ H* M; a8 p" h（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
% a1 U& \* J: A! `4 Z" z: d0 w5 v（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞4 G) ?& }% {3 y5 q+ Y
（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
+ Z6 c- L8 H# f
. L- g- a3 F) Z& Q [Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h
) \9 b6 S7 }9 W u0 _2 A9 X3 `（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1& R9 z5 s# u$ }9 ^5 Y' ~- c" h
（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
# t8 l6 t+ ]% d' G) V（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min$ }) j i% \5 O* N; p1 n
（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)4 K% P( a7 Y, y$ f2 N. H
（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.; z, s# c( m+ U7 E
PAUSE POINT
/ U) w! [. w y7 p6 h$ p0 h+ gThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
& ?6 W+ e1 a5 k/ _$ P% N* N8 M3 H! L* O/ {" o
解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）3 w# f/ }& x) u# j
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中
& b J9 [1 b. v @& g（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）, k* g! ~3 }' A4 A! s; I
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
S2 i6 r" B8 [2 }' a2 Z（4） 160g 离心5 min，弃上清! D) `. H, O! g+ j, \" q$ t# p
（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
0 { K4 t+ D8 ]（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
2 Y! W# g( n) \5 Y r' b8 {6 B- M) d; l
Plat-E cells传代 TIMING 0.5h/ u, V1 k' _- B" z) p6 a* g0 M
（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清4 Q; Q# _& m: i+ {0 s4 U# _
（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
6 j( A# V0 r( iDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h
d( c3 ^; e- X) P( w（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
& f, N) d6 ^' d) G; O（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S9 @& A% k0 n0 G% v9 h7 g# t
（3） 180g离心5min
; @, T- q" t0 Z0 M. Y（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
/ ~. h! p5 o8 e8 C% `（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
% x8 _% \! H; B; }, S4 [, Y（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2* g& D0 R# {/ Q9 l( Y$ l
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h' z, _1 L) e8 T6 N' a
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
5 K! N3 @/ b; L" w0 u" B（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min' Y8 q6 T) f H9 K8 ?7 O/ Y- a# X
（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
9 D: I; P2 ]- R; M" {（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
& Q# D9 U3 w* K6 t5 u- O5 A) R' s' o5 j2 C( `0 R
关键步骤# _% }$ s$ W6 t3 D) {" @+ w/ [+ g2 t
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
, P9 |$ D6 g% V8 T K* ?' X: q2 y3 W0 ? V; v
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h
& J" Q1 F- _' }2 ^$ F" n吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
1 n& Y8 h$ H B, Z. [1 j1 W3 CPreparation of fibroblasts TIMING 1 h1 a, M7 V( V% O
（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）0 c/ M4 `# {7 d% x! ?
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗
0 j- e. M# ]% v, K' B' t（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min) s6 s) X- W; k; I3 f6 _$ T7 N3 [
（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中4 g# p/ K: t, |5 g9 W, f/ Y
（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。( D2 o$ Y, F3 i
Day 4: retroviral infection TIMING 0.5 h
$ ^9 x# l- M2 L（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
: z1 n1 }* U" j% E) h l$ e2 _' T7 Z（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1; q8 j5 l/ i$ s# R6 ?5 o* }
（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
3 `' x4 Q" E8 l( ]) B5 {& S5 ~关键步骤, L9 e- f6 Z8 f; g8 ?6 @0 z+ M3 H: w
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
! d; E- U# r- H3 _* |1 ~, o5 m1 [% Y( J) S5 p2 Z5 R* u! e
（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜4 Q; \- b8 M" p( @" F
8 @* M7 P5 G& ]Day 5 and 6 TIMING 5 min each day9 u# M3 {( V0 i9 x5 @2 L" B4 \
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
8 \1 }# S0 K9 R/ ]. HDay 7 TIMING 5 min
3 K4 k) J& U+ V9 A) T" p- l, ?, N弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
3 \; @" G, m5 G% ]Day 8–10 TIMING 5 min each day
) y6 X; _4 a. m7 I9 V: f每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
4 w$ }$ G e% N( u# wDay 11 TIMING 5 min
6 d: C- u. E, A& ]& a For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1$ j! V6 f% e; Z& c# M' h
Day 12 TIMING 约5 min each day6 |6 P/ ~4 `& ?8 I. p p' t2 J: i
每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
. ^6 I- g6 O/ U! N; `6 Z1 F4 c2 YCounting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d
9 t0 M) t/ O% C（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
% `0 P( D* l) |* `2 g5 ]* x5 d) T7 ~（2） Wash the dishes twice with water.8 g4 n; ^0 r' T" j! `$ L/ g
（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
1 R' v& F& C) \4 y（4） Wash the dishes with water+ X6 P$ m- D8 \2 V( E: m- Q& i
（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.; \5 z6 U9 F' R8 Y8 r# z9 Y- u
- ~$ M0 q; X1 y* F! e5 tExpansion of iPS cells TIMING 1 h7 d& Q3 A8 W/ T. h/ G q
（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞% L6 a& F- a' j1 O' ^6 G9 u% h
（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min2 [3 A# V6 s' @% v
（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层$ ], W) S' B# j8 }1 k
（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）. G& C- T1 K- M; r& N, K3 f& U
Preparation of freeze stock TIMING 1 h5 R; k l t4 n" b- B
（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗
" R4 g4 a/ S; l, w6 `# ` ]7 }（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
7 D& i( Y7 d2 R+ v; ~（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
: K! ]9 r% P2 F& Q" L# R% w（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min4 x% m7 d1 [4 Z& c* _6 `) l
（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
$ s7 U8 D) `* a1 a7 M! d（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）3 R: O1 p. R/ V' r% D) o9 }
（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
' [2 x5 x3 ]* X9 h% G& ~（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）' P& ^/ D2 e9 c8 T7 a9 p
PAUSE POINT
4 V. B: @# A$ VFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.5 K( S( l$ k3 s7 w o
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发表于 2011-6-10 09:06
