又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

1 C! j, `: j% _2 b) O0 {
* ]/ O. f4 Z4 i: {& w* ]在此省略实验试剂和仪器设备步骤
# S) C1 O- g. B$ b) h成纤维细胞的制备5 M  {3 h6 g% {' ~' B
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies  j3 f. A4 T; s$ Q
A 时间：15d
8 W& j0 E3 ?% M: c# H& O+ z* q（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
1 L+ j+ m" ~4 D; t7 `（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
- h# x% j: S/ c' z& A" C5 ]' C6 `（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min , A3 E% |9 Y, T# y5 B1 V7 H
（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min $ y/ F% @! ]' [4 b, a
（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
  Z1 P6 H5 l; v9 L' ]4 x" M8 L（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
7 V+ \# S, ?+ x+ W9 v（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
7 M/ |5 G( i2 r( G（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
' ^$ ]0 t: N  r3 x（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and  O5 c- I* e. N/ x$ E7 c5 {1 s; S
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。' q, i# l4 L  X
8 K- g: r, h# ^' N
尾尖（B）时间：10d
4 D) u$ ]0 w% [1 ^9 D在此略0 y; L  H, I+ t. p% C7 U
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
! h* {9 o* y: L（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
  C& R3 m2 J* f（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
! J' Q! `! Y. `; ]: @（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）9 E' v- _; q( e' z4 y6 ?
（4）        160g 离心5 min，弃上清/ C1 _, G( N. w* }& i8 }- ]- A
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
2 D! R# n4 x! ^+ U3 w孵育，直到达到80–90%汇合
/ F6 {" l# \: T' _/ Z6 I' h  l. J" g: k! w( K+ G
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
% }5 X" `) m. {. V7 z. Y8 J' d  g+ o$ c  k3 q6 S
SNL cells的传代 time：0.5h
2 b1 w- Z3 k, k% {（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次# d, U$ f3 T9 @( e2 X8 ~; V& l5 E7 A
（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min: V3 s# w0 {5 t$ T+ z: Z" ]* g
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞! h* y5 [9 K5 T8 z& t
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage7 T- \' i* K" Z/ w+ s

' P0 V( Y  A2 d$ R6 lMitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h) ?" {' `1 ], {% \& u4 B& D, I5 Z# U; |
（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
5 Y- g; T! e: I* M5 d2 B! A（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。0 C& B- N# `5 g6 [
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
# }! E, i  F* O' z. p（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
) K+ u6 v  q% M+ M' m  A- L（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
( z# i! y9 A# r- U+ DPAUSE POINT+ R* F! Z7 i7 w$ p" S$ r2 Z3 E
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周# r0 c9 Q- |& ?2 B
+ d( U) g* ~; W) G; ^7 @* D
解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）. Z0 _" h- p$ G$ j/ D
（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中; K! _" X3 _. ~; H: Y  @) B9 g7 @7 x+ k
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）- c+ F- m1 x6 Z3 ^
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）, Q+ i4 \# ?6 g1 R
（4）        160g 离心5 min，弃上清" m2 e9 [1 d& S4 d
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
! R; X- I' x4 s1 F5 f4 v- M（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合( I, Z2 a0 e6 P7 Q
7 ^$ f" ^! m8 i$ ]# m2 B5 j2 Y
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h; H% c' i5 @, [6 H# _3 X- m) ]
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
6 t! F* k* d4 W. m（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
+ b$ h" p. W$ X5 b4 N# tDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
) a6 \- l! B$ n. R: j+ ^（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
6 B# V; ?) O  i7 `6 ?, v: X（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
3 O* U- o9 J  Z5 n$ v6 e（3）        180g离心5min
6 n  F) f4 W9 D: Z, z. K9 r（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
( i/ y6 i3 w4 ?（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml9 Q3 E8 g: _# W3 B) H
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
% N1 W; x3 F9 r  U$ Z$ ~7 k0 E; R4 UDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h
' h; L8 {5 g3 E3 l4 p+ p' K（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube& Y/ F7 A1 }* o& B
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
* x  u0 \7 }! Q- _1 q) @9 W! I（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min7 ?0 F; @; ^; J$ K$ v
（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜' o- u9 P0 P: |+ d) g& ]

2 C2 {+ S) |. ~9 M关键步骤
' D% G, p" o) ?1 X# S  m5 _Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction! w8 N  |4 \: a) s7 k, t1 R# y
. z  ^) F# h- Y7 n# }" q
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h
7 V' D5 o3 R% q2 l- u% `2 o吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
* {2 a5 c6 I8 t' H4 z/ x( sPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h
" t' Q$ U& z3 t. q( P（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）3 R  c& n$ i6 ~
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗
7 u0 d" `( {  d: A/ t3 B7 ^% {（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min, k- I! ~4 I/ u
（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
! _7 a. D8 c' z8 h（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。! C2 I/ e1 E! u; w% ~5 @4 w
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h) h/ {8 V8 i1 l; I
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。9 E' m% V0 M9 b( G- T
（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1  D  m" {  @$ L% z
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
' {3 S6 q$ X) {$ q关键步骤
0 A: {( B/ A/ n' lRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度1 o6 h1 ^; [$ s( q

9 x( g& `3 G! M- l* T; f( c, V（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜/ B6 n: r- c/ U8 V& G9 ?% b
8 r9 G* U; f* o" O" M7 G
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day2 P, ^: \( Y/ y9 B/ l- u- ^) m; S
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
! d+ h2 S9 p( V/ L1 }; hDay 7   TIMING  5 min
6 K3 e; l$ c" F/ X( |弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
0 E" H: c) P( a* p3 fDay 8–10   TIMING 5 min each day+ F2 k! A/ Y! L1 O. v# i+ y
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）- O3 A2 q) t1 K' k; D4 X( Z% }
Day 11   TIMING 5 min
: r& ^5 }- X' e( y9 w- G For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1! @# R7 Y8 G1 x4 S& ]2 k2 z
Day 12   TIMING 约5 min each day; Y) J' l" P9 {# z7 u
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）" ~, s( S8 E  [2 X# |7 ~: @: p& g* X( @
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d
, C) V/ @# Q0 q7 k+ d% ]8 T（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
. D3 `: e- v8 ~$ p6 m" Q- G/ k（2）        Wash the dishes twice with water.
  r: {  e4 J0 o/ D（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min# l: y2 Y- G# D$ s/ m0 k( R$ P
（4）        Wash the dishes with water* ]1 C% r* Z. u5 \
（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.8 c# ?' z! P6 f7 V7 f
! g" N/ u: d. q6 B! [3 r. U
Expansion of iPS cells  TIMING 1 h
3 ]3 C8 c& I- |( V+ i（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞% X: N. d7 R) C; x: d5 X, _
（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min! C5 t5 M; [8 I
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层7 P9 D, |" w' v( ?
（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
4 K& U" t; ?" |' }$ s. Y1 aPreparation of freeze stock   TIMING 1 h3 q5 S5 e: L9 Q
（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
/ I; f4 K5 W" q" r4 A8 n（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
# X) S$ `4 P' i! u. M（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
6 a# a( J7 M3 M. |/ h( F（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min" f1 s3 J, B" z3 R/ }0 L; I
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml+ P/ k$ j1 Q* Y* F! \
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）# G( j7 V0 D1 L; L% L
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
6 A! X7 f8 A8 P5 t（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
% S: h  I+ X+ ~PAUSE POINT
* Y* H1 c) F7 u8 E6 cFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.' {! V/ ]' [7 {! w, c0 p

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子
9 F5 Z# x: \5 @! u* K2 G# N& k, @
: g& K, R9 d; F" B* e/ Z这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子
* n6 v& C+ _. C" Z( f# R% V- o. ]  ]# O- b# P
呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子, b  E: g" L. Q/ K, t! i
8 |: T0 V! q- d' c
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是
3 N' r% x5 P7 X& `+ Y首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是: N; T/ ?$ @" K$ t- u9 Z
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
% R; A. e! `4 e# Y最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
. k# f7 M) Z+ [" a  }1 p
* y1 z; C5 F% @  T7 S没事，相互帮助嘛

huangcong1988

回复 always_wp 的帖子
7 Z$ U# r* |' W+ n8 W+ _* @. T; D9 R' |
分别啊，一个皿全部包4个毒，SO CRAZY!呵呵:)