又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程） - ips专区干细胞之家



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huangcong1988

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发表于 2011-6-10 09:06 |只看该作者 |正序浏览 |打印

本帖最后由细胞海洋于 2014-10-24 09:51 编辑

在此省略实验试剂和仪器设备步骤
成纤维细胞的制备  H- h. U  g: X2 r& U
1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies
A 时间：15d( [8 a" t- O5 H0 n( s1 d# d1 P
（1）通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
（2）用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除# d' L1 V/ i2 r. C
（3）将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min 4 X' O8 |3 h4 P+ i- U5 M: X
（4）另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
（5）加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。% y0 k/ `/ d8 K
（7）细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
（8）第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
（9）当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。

尾尖（B）时间：10d
在此略$ H# {; A" t( _% E7 M
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
（1）准备9ml的SNL medium于15ml的tube中8 h) J( n# Y$ H0 Z/ _
（2）从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）$ G. ^0 I/ T: P/ N
（3）用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）. b1 o; k* _- `% r; d
（4） 160g 离心5 min，弃上清
（5）用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
孵育，直到达到80–90%汇合" Y8 H7 O+ F# o8 o& L5 v

CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。

SNL cells的传代 time：0.5h" u1 l# q' {# u" L. w
（1）弃培养液，用PBS清洗细胞一次
（2）吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min3 V  S7 O2 G6 a4 W9 \4 ^* ]) \
（3）加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
（4）通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage3 K% X- u$ ]8 Y5 M6 H* \
) q8 Z' I" e3 o% r. H, p2 N- u; |2 }
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h9 c0 Y2 v: |' O! O8 P( j$ {& G
（1）直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it brieﬂy（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The ﬁnal concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
（2）孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
（3）吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min! Y6 c" o! t3 F7 N3 \
（4）加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)1 ~9 p$ _8 q; b% H- c' O, k
（5）细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.; E3 F3 ]& ^! B
PAUSE POINT  P) w$ N/ `& J2 q* T0 X# T
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
% o9 B3 f; G7 @+ g
解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）1 F6 v# v1 y+ ]5 t: R
（1）准备9ml的FP medium于15ml的tube中
（2）从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
（3）用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）' v: p/ [5 M! p3 [8 s
（4） 160g 离心5 min，弃上清
（5）用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
（6）第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合

Plat-E cells传代  TIMING  0.5h! X) O( j5 u  b) L
（1）吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清# c4 w: E; i0 x6 o: _; n$ D
（2）加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合. Y9 t$ E  @6 h% C. |$ k
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h& z2 a0 ^% r  }2 T# y
（1）用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min: L/ ^. U! I/ n
（2）之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
（3） 180g离心5min/ `: y1 z* l4 d# K9 [8 X
（4）弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮8 `- f! T& o9 y. Q. ^8 D
（5）细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h8 V! ?- ?! a5 B, F- f7 v, q
（1）移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube, M6 y* _' p* R; ^4 p; M9 \! T
（2）在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
（3）加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min  k# G8 k7 S& f4 T0 {) i3 u
（4）逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜7 x0 y4 a$ C1 ~7 G/ T/ Q' o
& J: O) F1 i9 H, j/ ?
关键步骤  ]5 e7 v( \, {$ Q" |
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efﬁciency。We routinely obtain efﬁciency ＞80%. High-efﬁcient transfection is crucial for iPS cell induction
( ^& B: v& l/ E' z
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h8 i9 O6 \6 P) V: _) C7 o- V
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
Preparation of ﬁbroblasts  TIMING 1 h# q6 d5 s" V4 e) r
（1）培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
（2）吸出培养基，用10ml的PBS清洗3 a8 N1 R5 H" w4 V: F" g
（3）弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min0 u% y3 _  ~% v0 p
（4）加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
（5）细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。, w) \+ V: ^! @" k  V* a! j2 v
Day 4: retroviral infection TIMING 0.5 h0 t2 W* w. V  C$ K5 G# F
（1）用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
（2）加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml ﬁltrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The ﬁnal concentration of polybrene will be 4微g ml–1
（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.. ~! f9 g7 H4 U) d8 ~& O) m0 x- a
关键步骤
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度) w( \# u5 g4 R* n8 j' f

（4）从ﬁbroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜! M! n( Q7 v: b' |) M& r5 ~2 v0 i
1 ^! h( s0 y- b% b  S
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day7 e4 d: T4 T  E1 g# g
24或者48h之后，从ﬁbroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS1 O# |& o- b0 ~7 s. z- s: K6 D+ d/ _7 m5 |
Day 7 TIMING  5 min/ r6 R) K9 B: l' b! r% M
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G4187 D6 Y; c; Z7 X+ V
Day 8–10 TIMING 5 min each day6 N$ }+ L8 d4 W
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）, n2 u5 F1 e( F
Day 11 TIMING 5 min0 k8 z, a* A) [8 r
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the ﬁnal concentration of 1.5 mg ml–14 Q4 N/ v4 B9 s8 C1 L% \
Day 12 TIMING 约5 min each day: W! X7 d; ^4 t5 z" ?
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should ﬁrst become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）& ~" K9 v9 w' s) j8 x  a1 H$ z
Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d7 M& @3 q( O% j- V+ Z  C' q6 M
（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
（2） Wash the dishes twice with water.
（3）加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
（4） Wash the dishes with water# i" Y3 \. Y0 b% f
（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.- e7 G' f( N: y  W! m

Expansion of iPS cells  TIMING 1 h
（1）弃培养基，用1ml PBS清洗细胞( P, r3 p5 ~" E8 d3 V. w! n& q/ p
（2）彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
（3）加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层6 I' O! _0 \, Q3 f! l
（4）将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
Preparation of freeze stock TIMING 1 h1 I9 O% r5 d0 W  W3 P' _
（1）弃培养基，用2ml PBS清洗+ P  p9 c# v3 z# Y
（2）彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
（3）加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层: [1 ~6 }  C3 [& u! i
（4）将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
（5）弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml* z0 [" W! T: m5 Z- x, ]
（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
（7）加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）7 Y: V; a& J% y' h: G: m& B) m5 k
PAUSE POINT8 O( S. g' M8 |' y" k
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.

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