miRNA模拟物的转染体系与步骤

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。9 f1 x2 k- e! G0 W+ |! B
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
7 W5 k+ j3 H9 S, R: l+ ^3 f/ \B. siRNA-RFect混合物准备：
  G! h5 Y* N  o8 b; R6 T% G1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。8 {7 M  R. c4 Q
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。/ L& U0 i5 I3 F3 R1 q  A- L
3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。% _3 o- ^/ k' u8 x
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：* B" X8 d1 v5 G
1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
/ ?. W( y' u: h( l- U7 }2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、1 f7 V7 Y; i0 d& X% _
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。