大家包装的慢病毒滴度是多少（不包括浓缩）

ying

我差不多是10的6左右，浓缩之后基本达到10的8，凑合用～  n4 M( i3 z* W- Y  l
转录本里面要是有miRNA什么的，会导致包装效率下降，因为有一些本来可以包到病毒里的RNA被裁减碎掉。如果没有会被剪掉的元件的RNA的话，要是比较小的插入片段，估计应该有10的7左右吧。+ L9 x/ |, ?0 q' t7 {" L

ying

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9 e! R5 v: [) ^7 N# ~# a' ]
; x$ F) Y# k0 W) x! e5 b我是VSVG, delta-R8.91 和pGIPZ三质粒系统。我不知道是不是invitrogen的，因为是从我们实验室别人那里要的体系。protocol不方便给你原版，因为是别人整理的。但我可以说个大概。就是，用10cm dish 满的293T一盘传4盘（10ml培液），这4盘都不加双抗，培养24小时，大概达到50-80%覆盖率。这时候做个类似于lipo2000的转染，按标准的lipo的protocol转。就是一只管子加optiMEM和lipo，一只管子加potiMEM和质粒（VSVG:R8.91:pGIPZ=1ug:3ug:4ug，对于10cm大盘），之后混合，放置15分钟，再滴加到细胞里。12小时后换液换成有双抗的培液（DMEM加10%血清），之后36小时收一次病毒，再换液，再24小时后收一次。大致流程就这样。我觉得最关键的就是转染效率，建议你用个GFP的质粒先摸转染条件，主要就是lipo加多少，质粒加多少。效率要90%以上GFP阳性才行。2 \' U2 b2 ~# E0 V9 \( q  D
如果你包装的是shRNA或者miRNA的序列，这种病毒滴度本来就不容易做的高，因为有些RNA自己会被切断，而没法包装成病毒。只有幸存的RNA才会包到病毒里。! ?9 c  _, I8 Z1 `5 b' U, o8 X
祝顺利！

ying

回复 huangcong1988 的帖子% ]0 ~, m) L  l1 s$ o0 E+ O! U: n
, j) |5 n/ t  e  b& }! T
浓缩后加的培养基可以是你转染的对象细胞的培养基呀。如果你足够猛，就直接把这种浓缩过的东东当作培养液加到吸走培液的细胞里，那就浓到了极限了吧～

ying

回复 huangcong1988 的帖子$ d9 e' I: D3 a* g1 @1 `2 o

6 Z* D3 ^) f+ `' Z按这样说来，确实是被稀释了。0 l, {# T: n$ C& b3 z
不过，通常我是这样认为的:$ ~0 N% m  l! z" ]8 |
一开始没浓缩时，假设体积是100毫升，
! D4 a4 r$ X, _( d: S浓缩后，变成一个坨坨，) L7 h% i3 s8 ~: _- H
把这个坨坨用1毫升的溶液给溶解了，
0 T+ Y. u, l! j. g8 k3 t6 }假设病毒没有损失率，那么就算是“浓缩”了100倍。因此用我的观点看，是“浓缩”了。

ying

回复 salomemao 的帖子0 Y, R5 s5 ~! K4 a, A
6 T1 @3 N% I' T) a9 A) F
转染三质粒的时候，我们实验室的protocol是不加双抗的，据说双抗会影响我们的体系的转染效率。原因我也不知道。之后十二小时后我们认为质粒已经进到细胞里面了，所以再加上双抗防止污染。

ying

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是啊，让你见笑了 ：）

ying

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我是用50毫升离心管，PEG6000和浓NaCl来浓缩，低速离心。一次可以离35ml，最后溶在400微升里面，扣除损失，估计浓缩应该在80倍左右。我还用超速离心法浓缩过，那个方法得到的坨坨很少，因为坨坨主要是血清里的蛋白，超离的时候很少下来。超离我是37毫升最后可以溶在大概200微升甚至更少。

ying

回复 salomemao 的帖子" I* f6 w' t. P. K
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ying

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4 S8 T; g3 v  P. M! Q" ~6 p, z; F+ ?' X, v' C( U/ g: S
是的。