细胞冻存与复苏

mtdj1314

9 M" M; S& ?/ c0 S. c
" x" Q. }7 t" D: t: ]5 w! q
       我养的是脐带间充质干细胞，取p4代冻存，冻存前细胞开始融合，采用FBS：DMSO：含10%FBS的DMEM=3:1:6冻存体系，T25瓶子长到90%冻存，冻1支，1ml。冻存程序是4度30min，负20度60min，液氮表面悬挂过夜，次日复苏，37度水浴，2min内融化，转入已经加了8ml完全培养基的10ml离心管，1500rpm离心5min，完全培养基重悬后种瓶，复苏贴壁率才70%多点。
8 ^( D0 v( j* M9 J: w7 |% n  p5 i       看了论坛不少研究者的回答，基本都在80%以上，好的还有90%多，而且细胞冻存密度更小，有一个T25瓶冻2支，复苏时候1支种2个T25都还很好的，很讶异。都说经验要靠自己的双手去探讨，但是在摸索数次后，我还是想请教各位，在冻存与复苏的过程中，还有哪些细节会影响到最后的复苏贴壁率。( K5 ]8 |9 n! o+ q; A
      我自己琢磨以下几点：/ n) U/ s  S8 F# J5 U# \9 ^
      1、细胞采用第几代冻存？
7 T9 q9 o/ K% n) x  q3 z      2、冻存前细胞汇合度多大？
3 L7 J8 {; T$ O4 r/ j8 I0 U7 W$ N      3、冻存体系比例？加冻存液的方法？
) x& s5 P! E. }5 ?      4、冻存细胞的程序？包装？! g/ \: K3 M7 Y
      5、复苏细胞时候的手法？
7 B; t- v0 }; I  L3 _      6、复苏细胞种瓶/种皿的密度？
; K3 }) c6 M1 J      7、我想知道各位在细胞复苏后，大约多长时间达到上述80%、90%贴壁率。

加贝

我一般是冻存长到90%的6cm皿，细胞消化、离心，去上清，用900uL的胎牛血清重悬，移到冻存管中，向管中缓慢滴加100uL的DMSO，混匀，放到冻存盒中，置于-80°C冰箱。复苏后细胞基本都能贴。我养的干细胞比较娇贵，所以用900uL血清，有的细胞用300uL血清+600DMEM就行了。

184lj

1、最好冻存5代以内的细胞；
8 D6 Q$ _  c8 Y* [/ [0 c' U2、细胞汇合度90%左右；
% h4 X1 L3 H  x+ ]8 H" S  C/ ?5 j3、冻存液现配现用，冰浴配置，要提高活率可以提高血清所占比例（复苏时，培养液中血清含量也要相应的提高）( T( F2 Q; V; H3 U( b3 s
4、4℃ 30min，-80℃ 过夜，第二天液氮保存；) Q9 b9 _) G: m
5、解冻迅速置于，37℃水浴，管内留有小冰渣即可；8 a3 K& G% ?* Q" y
6、冷冻前、复苏后，培养器皿规格最好不要变。

mtdj1314

回复 加贝 的帖子
1 w1 |' C: `0 i5 H
, E7 A" I, u3 {% z# u你好，谢谢你的回复。冻存盒是什么牌子？什么型号呢？这个我一直没有用过，想知道详细点。还有我的细胞融合了，边界不清晰，是否也不太合适？

mtdj1314

回复 184lj 的帖子
1 X& }; c+ @# w% f' u& M
, A( n' m3 T2 Z- A你好，谢谢你的回复。我有几个问题
7 U0 e' E# t# h9 F( V5 ^; L1、你们脐带间充质干细胞可以养到多少代？
- f' |7 v2 E8 Y6 U2 R2、我的细胞融合得边界不清晰了，是否有问题？4 O: U+ p) U6 B
3、复苏时候血清大概多少？20？
* w. J; @" ?9 B8 J4、冻存时候不需要经过-20度？还有放置4度和-80度的时候是冻存管裸放，还是放入冻存盒再放？冻存盒品牌型号能够告知？
4 ]& G2 A) W& R  J- z0 E5、你们一般复苏贴壁的有多少？
' ~6 ^) U1 J% l+ H% K问题有点多，麻烦了

cantonchn

! r+ o4 L9 t& I  C# _2 O7 r5 @7 L
5 d- m+ d' f9 M" eMSC理论可以无数代，但是最大10代就极限了，5代应该就开始衰退和分化了，最好的是2~4代之间。

jiguojie87

     1、细胞冻存一般取5代以内的细胞比较好，我们都是用2代的。
) r6 K" H7 n+ V0 b, [      2、冻存前细胞贴壁达到90%左右，如果时间再长会影响细胞的活性，但是时间短的话就太浪费了。
4 f: M$ V$ z  M( K! Y      3、根据细胞量冻存，大概1*10的7次方一管，每管1ml。冻存液：血清：DMSO：DMEM=3:1:6冻存体系,我们现在改成血清替代品了。配好的冻存液最好预冷使用。
! m) A1 C+ M. y6 b7 \4 [1 Q      4、4℃ 0.5h，-20℃  2h，-80℃ 过夜，第二天液氮保存；' @$ a+ S  f0 ^2 z7 x
      5、复苏细胞时候39℃复苏，时间尽量短。9 X. L* F8 v) T  M7 m4 y
      6、复苏细胞种瓶/种皿的密度？& z1 g) M, L6 _2 t+ L0 l
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