细胞冻存与复苏

mtdj1314

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& q7 i- n# M* h! R% L* W! @) `       我养的是脐带间充质干细胞，取p4代冻存，冻存前细胞开始融合，采用FBS：DMSO：含10%FBS的DMEM=3:1:6冻存体系，T25瓶子长到90%冻存，冻1支，1ml。冻存程序是4度30min，负20度60min，液氮表面悬挂过夜，次日复苏，37度水浴，2min内融化，转入已经加了8ml完全培养基的10ml离心管，1500rpm离心5min，完全培养基重悬后种瓶，复苏贴壁率才70%多点。$ d3 d5 O8 O* g2 M
       看了论坛不少研究者的回答，基本都在80%以上，好的还有90%多，而且细胞冻存密度更小，有一个T25瓶冻2支，复苏时候1支种2个T25都还很好的，很讶异。都说经验要靠自己的双手去探讨，但是在摸索数次后，我还是想请教各位，在冻存与复苏的过程中，还有哪些细节会影响到最后的复苏贴壁率。$ F5 Y6 [' a6 i7 w3 s* R3 F: g
      我自己琢磨以下几点：
" q$ m7 G+ @+ t9 I1 C2 J      1、细胞采用第几代冻存？
" A3 C1 O6 E" x      2、冻存前细胞汇合度多大？9 w% D: Q4 F: T) P: `* o
      3、冻存体系比例？加冻存液的方法？& i! [7 k1 d% A; v  l+ P* Q0 ]+ T
      4、冻存细胞的程序？包装？7 U9 A. S; w; ^5 z3 j# o
      5、复苏细胞时候的手法？9 {" h3 |/ q4 h7 r' M; V
      6、复苏细胞种瓶/种皿的密度？- @0 P: K* N  g& }
      7、我想知道各位在细胞复苏后，大约多长时间达到上述80%、90%贴壁率。

加贝

我一般是冻存长到90%的6cm皿，细胞消化、离心，去上清，用900uL的胎牛血清重悬，移到冻存管中，向管中缓慢滴加100uL的DMSO，混匀，放到冻存盒中，置于-80°C冰箱。复苏后细胞基本都能贴。我养的干细胞比较娇贵，所以用900uL血清，有的细胞用300uL血清+600DMEM就行了。

184lj

1、最好冻存5代以内的细胞；
3 X- T( S1 y: E& f3 d/ Y2、细胞汇合度90%左右；' b( V7 O! `/ E  W1 d0 c6 q2 B' l
3、冻存液现配现用，冰浴配置，要提高活率可以提高血清所占比例（复苏时，培养液中血清含量也要相应的提高）
8 e3 a* w1 k4 C4、4℃ 30min，-80℃ 过夜，第二天液氮保存；
% V( C- F$ T3 G" J; S  F( L) N* m5、解冻迅速置于，37℃水浴，管内留有小冰渣即可；. k# o0 }" R8 e
6、冷冻前、复苏后，培养器皿规格最好不要变。

mtdj1314

回复 加贝 的帖子
6 q( M1 ?& q7 W0 p5 i. @0 z  T& F8 r5 Y* u* l1 N. n, C
你好，谢谢你的回复。冻存盒是什么牌子？什么型号呢？这个我一直没有用过，想知道详细点。还有我的细胞融合了，边界不清晰，是否也不太合适？

mtdj1314

回复 184lj 的帖子2 \' c, {, i5 ?. r( E3 l% l

+ d: _% ?% g" `2 c+ n& X你好，谢谢你的回复。我有几个问题- }3 Q5 p" L+ ?/ o& s  @
1、你们脐带间充质干细胞可以养到多少代？
, @; E% c- g- `4 U  B$ g2、我的细胞融合得边界不清晰了，是否有问题？6 A1 f( M' l9 G
3、复苏时候血清大概多少？20？
! \# O1 h' T. }& h( _! ~/ H; h4、冻存时候不需要经过-20度？还有放置4度和-80度的时候是冻存管裸放，还是放入冻存盒再放？冻存盒品牌型号能够告知？* i1 F( l* P+ r1 X  h
5、你们一般复苏贴壁的有多少？* ?& y# S$ d% R+ |1 F
问题有点多，麻烦了

cantonchn

$ X2 N$ G) m/ q+ v' Z* I/ I: |9 {4 S; C. X8 h6 Q
MSC理论可以无数代，但是最大10代就极限了，5代应该就开始衰退和分化了，最好的是2~4代之间。

jiguojie87

     1、细胞冻存一般取5代以内的细胞比较好，我们都是用2代的。4 R/ D8 F' P3 }4 U2 N8 f* _* Q
      2、冻存前细胞贴壁达到90%左右，如果时间再长会影响细胞的活性，但是时间短的话就太浪费了。* s; B; C. Q, d: D% a! R
      3、根据细胞量冻存，大概1*10的7次方一管，每管1ml。冻存液：血清：DMSO：DMEM=3:1:6冻存体系,我们现在改成血清替代品了。配好的冻存液最好预冷使用。$ i7 b$ @( q- Y" m# {5 I3 w# ]
      4、4℃ 0.5h，-20℃  2h，-80℃ 过夜，第二天液氮保存；$ y0 u! l8 w& y& t
      5、复苏细胞时候39℃复苏，时间尽量短。
( Z! _! R8 d6 Q' x0 ]      6、复苏细胞种瓶/种皿的密度？& z1 g) M, L6 _2 t+ L0 l4 v: ^% Q$ X. {9 u& }2 C