细胞冻存与复苏

mtdj1314

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       我养的是脐带间充质干细胞，取p4代冻存，冻存前细胞开始融合，采用FBS：DMSO：含10%FBS的DMEM=3:1:6冻存体系，T25瓶子长到90%冻存，冻1支，1ml。冻存程序是4度30min，负20度60min，液氮表面悬挂过夜，次日复苏，37度水浴，2min内融化，转入已经加了8ml完全培养基的10ml离心管，1500rpm离心5min，完全培养基重悬后种瓶，复苏贴壁率才70%多点。, L, G' d2 I+ @, N- Z0 O
       看了论坛不少研究者的回答，基本都在80%以上，好的还有90%多，而且细胞冻存密度更小，有一个T25瓶冻2支，复苏时候1支种2个T25都还很好的，很讶异。都说经验要靠自己的双手去探讨，但是在摸索数次后，我还是想请教各位，在冻存与复苏的过程中，还有哪些细节会影响到最后的复苏贴壁率。/ [+ C5 I5 j9 u' `2 K
      我自己琢磨以下几点：  w- O4 ^0 L. o# O$ Z
      1、细胞采用第几代冻存？9 @; ~( C9 J& c- y) h
      2、冻存前细胞汇合度多大？- h9 P0 |# ]. y6 [6 F% ~$ E
      3、冻存体系比例？加冻存液的方法？. [& ^# a( L0 J2 j4 r# G  q
      4、冻存细胞的程序？包装？$ r, k5 Z3 V6 y6 r
      5、复苏细胞时候的手法？
) `9 V3 s. W, F9 b  [# M& ~8 |" j" X  {      6、复苏细胞种瓶/种皿的密度？8 d/ {- \. y5 r( y  ^$ A# F) w
      7、我想知道各位在细胞复苏后，大约多长时间达到上述80%、90%贴壁率。

加贝

我一般是冻存长到90%的6cm皿，细胞消化、离心，去上清，用900uL的胎牛血清重悬，移到冻存管中，向管中缓慢滴加100uL的DMSO，混匀，放到冻存盒中，置于-80°C冰箱。复苏后细胞基本都能贴。我养的干细胞比较娇贵，所以用900uL血清，有的细胞用300uL血清+600DMEM就行了。

184lj

1、最好冻存5代以内的细胞；% u+ T% S& `3 P
2、细胞汇合度90%左右；
4 T' n+ }2 Y/ [3、冻存液现配现用，冰浴配置，要提高活率可以提高血清所占比例（复苏时，培养液中血清含量也要相应的提高）9 x( N! Y/ X: B; Y
4、4℃ 30min，-80℃ 过夜，第二天液氮保存；/ `6 m9 H. E0 B3 C
5、解冻迅速置于，37℃水浴，管内留有小冰渣即可；% |: f9 ?& t1 [5 z5 {. H$ y: p
6、冷冻前、复苏后，培养器皿规格最好不要变。

mtdj1314

回复 加贝 的帖子
0 ?; F( j, G6 C% t
! c# \8 g2 z$ U你好，谢谢你的回复。冻存盒是什么牌子？什么型号呢？这个我一直没有用过，想知道详细点。还有我的细胞融合了，边界不清晰，是否也不太合适？

mtdj1314

回复 184lj 的帖子9 t+ S# d" c: O, \

! A/ B) [* d7 m9 o! h6 j# I* `4 a你好，谢谢你的回复。我有几个问题( N& V# _& y6 c2 n
1、你们脐带间充质干细胞可以养到多少代？1 O6 r7 g" C: K9 v
2、我的细胞融合得边界不清晰了，是否有问题？% s  T; m) [/ A3 a' g, c
3、复苏时候血清大概多少？20？
1 [  e2 G; V" |6 \* E8 S, G, f) W4、冻存时候不需要经过-20度？还有放置4度和-80度的时候是冻存管裸放，还是放入冻存盒再放？冻存盒品牌型号能够告知？% Z4 K" S6 I" c
5、你们一般复苏贴壁的有多少？
' n! f" c* E7 e$ m问题有点多，麻烦了

cantonchn

# J" Z* l/ p3 k
0 {# o3 _3 ~  ]MSC理论可以无数代，但是最大10代就极限了，5代应该就开始衰退和分化了，最好的是2~4代之间。

jiguojie87

     1、细胞冻存一般取5代以内的细胞比较好，我们都是用2代的。# c) v7 b2 {0 ]
      2、冻存前细胞贴壁达到90%左右，如果时间再长会影响细胞的活性，但是时间短的话就太浪费了。
' N$ x% p0 t& }; I      3、根据细胞量冻存，大概1*10的7次方一管，每管1ml。冻存液：血清：DMSO：DMEM=3:1:6冻存体系,我们现在改成血清替代品了。配好的冻存液最好预冷使用。9 A! v, B8 M+ W9 f% y& D& Y+ B
      4、4℃ 0.5h，-20℃  2h，-80℃ 过夜，第二天液氮保存；' k1 Y5 A3 y( ?$ F
      5、复苏细胞时候39℃复苏，时间尽量短。
/ I* s% w" b; ~6 T3 _7 T) e      6、复苏细胞种瓶/种皿的密度？& z1 g) M, L6 _2 t+ L0 l; _$ z7 Q7 Y7 V6 M