DC-CIK细胞的制备方法

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【背景】& u% t1 V, f5 T3 x! Q& @
        CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。+ Z* I' f* ?9 S1 d
  2 Y7 c6 G: M% `) c1 ^# u
        DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。( c' v! F, O' l, @7 _( F
  
6 [3 \/ L/ z4 Q9 V2 V         DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。0 F. K, t# n8 O' T& A0 t' X
  
* L7 x! Y+ T8 H$ }【培养原理】
  u5 n+ ~' s0 B0 I1．DC培养用细胞因子：" Z! ^+ A. G0 [) j5 \  y

5 p+ ]! d6 ~  K  G0 D$ Y. u( v$ x•  GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：
3 ^' M5 d: \& G- ^% T- u1 k7 o                GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细
! m  ~2 f7 N7 ?) b         胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的 功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。
3 s2 c3 Q) |8 {" w5 P; `  
7 Y8 C2 B7 t1 a& K# a+ ~8 x                GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，. Q6 U7 v+ b2 @/ V1 n2 L: T5 P
         从而增强细胞的抗原递呈功能。 此外，GM-CSF还可促进DC的存活。+ y' I: W2 c) J: ]- G+ n: c
•   IL-4 (白细胞介素-4)
' y: C) @% p$ W- g3 {+ B1 f  C                 IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向, K! B! H) ]3 L% c: Q8 |
         分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能
7 I* ?/ g  E( P5 q- o4 E* x/ ]         力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
# E0 ?/ {' ~( P+ \! U2 Y) B  ; f3 r3 v; t  t+ |
                GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取 8 M9 A$ o6 C% W( C% O
         和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不8 r3 h2 b1 U: y
         表达CD14。
! u2 ?9 b  ^, a7 _; ~•   TNF-a(肿瘤坏死因子-a): a" N0 o  ^7 D0 b7 `6 K* q
                 TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II     5 r1 Y9 }9 Q7 V. f( y
          compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟+ r% |  Z6 Q1 P; B! E
          DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的/ L! v) v) `/ I3 H( [
          激活T细胞。
( Y2 k9 W. t. u: H  
# ^& Y( _% U  W  j: C, H- F2．CIK培养用细胞因子和抗体：  •    CD3激发型单抗：
3 }# N% w% z7 S, ~                 T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈
) u3 K. J- O# u9 z6 Q' L+ y0 \; T          的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表+ J8 L' X* [5 k/ u# c
          面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的  . T$ e8 W. y$ H
          辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使) m3 M, E! S/ I* S- [$ P, i
          CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸; z; n- q9 L# S7 W: o
          (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇
( v. @# ?) O6 V+ e/ k          途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(
+ l  x  T' P9 V" Z$ K          如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。* G* M& A. O+ N! M* n  ~# y+ o
  - |9 v9 N3 r( i2 ^/ `$ i6 R
                 由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子
/ A# ?9 ?/ c/ m- |% P          特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激
, c+ M( l9 @  u          活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能 够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，( [: t$ S& t/ b- T0 Z$ v
         从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 + \6 ?: \! }1 c' ], j3 {4 H) @8 e
          0 G. R6 S1 o2 }! L9 w/ X  f& Z9 ?
                 此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺
# P5 _  C5 l" y. w) k           激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养* y( [/ ~+ e3 O. W
           时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。; Q9 s( a$ e+ y6 q+ g) H, ]$ Z) T
•   IL-2 (白细胞介素-2)
( Z  W" u: V  G6 `* b: t                 IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-
  j+ }8 C/ q! @. w% H' V( r           2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞
) ]  M+ \) L  Q1 _% T           活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加" A. B6 _" w+ w1 j2 L9 ?/ T  L
           IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
- C6 `1 ]/ Y& A( l3 a& t/ S•   IFN-g(干扰素-g)
& Q5 }/ s- v2 e! {6 E& O% R7 J                  IFN-g;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强
/ l6 Y6 D9 I* m           度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活
1 S1 G6 o" c0 k0 N8 R           性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
1 p& f- L1 t2 y# x5 }6 ~1 }' F% _•   IL-1-a (白细胞介素-1a) 　; p6 m# `4 P+ K9 P
                 IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显/ N/ }( z1 \! R4 W  K; s/ C
           提高CIK 的细胞毒作用。$ l3 F2 V+ @& P/ k- d; L; J
  
5 }: Z# e- ?. Q- A【细胞制备】
6 A% Q- u3 F' m# X; @1． 外周血单个核细胞的采集' e$ q( B# g9 z6 `: `7 v  ~
        1.1      用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；' Z: u+ I. i- X" {6 e, ]
        1.2      淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。5 {, p- I- w. W. \- w9 B: t- v8 z
        1.3      无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。  ]" S" `6 Q1 E, `! g
   4 s# u: h" T* ?* }; g
2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备 8 s0 @. B$ R- k9 _$ X' W/ v) H1 r
                 用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-4 S- Q: q# G% x6 L* l2 f
         Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
5 x5 _! W0 C2 `, O) M7 u9 w  
* A  U5 H! K  D2 O                 用TSA或TAA负载的DC具有很好 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，1 B2 z' p/ X* K6 k( [! o' M3 O
         而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆， 从而
6 A7 r/ R: n  _" M         实现对肿瘤细胞的有效杀伤。5 P! U; B  S+ R) ]
    5 N2 O4 W; Y' U0 a$ C( _
                 肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或. `* k- D2 w' M1 |2 j; G) d
         死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤 活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞
% W6 A/ f+ a& o6 }; I+ z         裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
9 l& B  z- t7 N+ C) b( T7 K" _  , n% z( A  M* r) J0 `3 [
                 反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：0 y# G: l9 t% z+ C! }: _
          2.1      手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
) s4 l2 ]: k8 v. k' ?- U' Z$ U5 c          2.2      无菌生理盐水洗3次；
* j8 n9 R' L( Y* K3 v8 {          2.3      用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
* s) X& O; B8 F$ n( {9 I          2.4      200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；- R0 p  W! S3 h6 t! G7 [- D
          2.5      用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；: i3 T8 o& a6 W/ O6 v0 a
          2.6      将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；) C7 J: m( P8 }$ i
                   注：也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。, u( N( [  e; u
          2.7      将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
0 r9 \# V6 q  W9 C9 P          2.8      收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；, B# w6 W0 D( E# V+ P  M  H
          2.9      -80oC保存备用。3 D& B; m7 E6 c. C( }: f

+ U9 p5 }+ Y  [5 S" Q0 ^" ]/ s 3． CIK细胞的培养及鉴定
& i" d! }/ G. T, O          3.1      步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
; b& Q: d/ P! @) \          3.2      37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;( H* B9 M* U; {0 [1 [  n
          3.3      收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；
/ A$ a0 E) T% J6 V' M- G2 h          3.4      加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；! L8 F7 p4 m% l4 V& A- ]
          3.5      24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；
& v$ g1 X. o; E2 D  i( p                     注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。4 Q; c% [& a. b+ w
          3.6      每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；+ M& \- o8 q, p
          3.7      在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
# S% o8 N" n- J2 |) ?* e& V/ H          3.8      CIK细胞质控：( A9 L% d: b) p
                   3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
- Y- c  p" r# C, f9 o                   3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明
% j$ d7 w( Y1 f9 t6 n* j                              显提高。) y9 M9 x  Q$ S
  
2 a4 ]4 U6 o- F1 U7 |- @ 4． DC 细胞的培养及鉴定
3 T! {4 Y, V% [- u+ @3 N           4.1      步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人2 h' T8 j& b  r& N5 H. s( d
                      IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；  Y$ @: `7 |; X0 Q
           4.2      每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；- P$ r" }2 {( }# x( d! Y/ U
           4.3      (可选步骤) 在培养的第5d， 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
: J4 b# E( x  p2 ?                      注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。: I: w% @) U. Z8 d
           4.4      在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；
4 n! N% y1 s! A1 y* P( i           4.5      在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
9 |  ?$ U5 n# P4 i0 e. s           4.6      DC的质检：
* Y& \% v4 i! v6 X, V3 d9 b                   4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；8 v! J3 @/ X( D; R* z
                   4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。; ]! B3 U# j7 F" \9 o
  & b0 W( g5 ~: B4 A
5.     DC-CIK细胞的制备和质检
* y7 S7 c4 g) U( D0 z           5.1      收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添! L( k# _! Z) Q; R6 G& J
                      加重组人IL-2 (300 U/ml)；4 X& {3 V+ Q# V) ?) q( |' @9 a
           5.2      每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
% _9 a1 o  D) v7 L3 H) x# W8 K; z           5.3      在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；* h* B$ d: Z5 G
           5.4      DC-CIK细胞的质检：
$ F3 P+ f* d, U6 \6 t( _                    5.4.1      台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；+ m" M" N+ q0 A- e
                    5.4.2      流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%4 M, s! \2 ^- A9 C, d, t+ F1 i
                                   以上。
$ {1 i) l2 s  p. x" X7 b                    5.4.3      细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶, x8 n1 d% u- @
                                   细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 1041 h2 s1 w7 u8 A4 o" n! X
                                   个，终体积 为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检
0 i6 k& e/ c( w0 {. I                                   测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
: Z- o5 H9 s; H: k8 W& h" j                    5.4.4      收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病
* J" _2 ^# Q6 |  r! v* P                                   原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
# R8 N& y6 G+ S* _  a! e9 j' y+ U, ~7 |2 ^& Z  j4 r& \0 A( N
版主加注：不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。（四楼aidiulgy9517异议，尚需进一步确认，请大家跟帖讨论该问题） 3 c0 Q1 \+ w$ E3 W* G
  【步骤简图】
1 \+ F. E+ B+ M  I, F8 T
7 ~3 v$ j( E/ S

yakunsong

学习了，非常感谢

mmssyyee

很详细。

aidiulgy9517

回复 defu 的帖子
) _$ ~, D  V$ w
  H7 N4 r4 _- y很好，谢谢！ 不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。

Life_Tech

支持，很好的内容。

刘艳85

想问一下，CD3用的是什么厂家啊？谢谢

细胞海洋

回复 aidiulgy9517 的帖子8 `/ ]2 z$ y$ p" ^# V

# \/ _% e9 W3 T1 z你好 这个问题我不懂 因是会员发布帖子 尚需大家来共同确认是否存在错误。
0 x' X; l% L, j4 R+ E , _4 A" F% M6 c# w- @
帖内已经红字加注，你能说明一下具体哪里有问题，如何修改？
9 v9 a0 h" m. D( O( |" G* v - f- b& T: t! A/ n# Y6 y
谢谢你的支持

helong

DC的培养方法已经发展变化了，上述方法算是经典方法，但耗钱费力。6 ]7 c) }! @/ U* }
CIK是非特异的方法，DC具有一定的特异性，DC-CIK联合则兼具特异与非特异，实际情况是不伦不类。
/ d+ O3 H- w. u! X" N3 y实际应用中，我相信CIK+DC方法优于DC-CIK！

aochongyu

很好的帖子，顶一下

helong

回复 细胞海洋 的帖子; Q' Y+ D. g% d8 o

8 v6 [' x  ^: E# x6 s& G% |& y看来斑竹也是大外行