DC-CIK细胞的制备方法

defu

【背景】
/ d7 m% L. B6 ]        CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
& W, g  H  {) L9 b+ H9 j  
& f6 n6 O1 E5 D( J7 J+ t  K5 g- O( j        DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
- {7 d+ n9 y1 A1 B7 o+ d4 W  
. y; p  I5 Z! S3 f3 }$ ?  s         DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
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【培养原理】
/ h9 B+ `  c% I' V1．DC培养用细胞因子：
1 |  T4 d3 `- Q( h( `2 {% a) }) Y% |& J" c; q( P
•  GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：$ H3 ]! E* E- W
                GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细
5 [' e, P$ N8 I( f" X         胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的 功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。
2 N% \9 g9 O! b- P+ A  ' u+ m% n: Z5 c# `
                GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，, X- A" Q5 e' s7 ]& ?+ ]6 x0 a
         从而增强细胞的抗原递呈功能。 此外，GM-CSF还可促进DC的存活。- v8 q9 r. ?" ~( N/ j! _
•   IL-4 (白细胞介素-4)
4 O# d1 N, `! C1 {) X8 J) t                 IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向
, z# S. m7 ?/ l# _1 a         分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能4 D; a% m! O$ N  T0 N8 U  W7 q: P2 L
         力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
5 z4 U3 o% \9 Y+ ^1 J  
  P0 K+ y0 X, n; t& R. C" N                GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取 3 C2 m8 J! m2 W5 x6 K
         和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不
/ W9 \* p4 G6 G, G* A' V         表达CD14。$ b% _; K: @. W% H- K3 x  |
•   TNF-a(肿瘤坏死因子-a)
/ F+ u% I2 t$ H3 ^6 ]                 TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II     
$ h2 T1 y+ `0 m9 o          compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟5 ?" K: ]- ^, x
          DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的
7 k2 w! |% b4 v4 _) {* f          激活T细胞。. z7 U& {1 x6 ~9 P. i
  
% D4 q" F; f! r4 z  X2．CIK培养用细胞因子和抗体：  •    CD3激发型单抗：: @3 K7 D# ]( r* n4 H0 O* f1 U
                 T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈
# W3 R+ z, p9 _) q: D8 `          的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表
3 e: o1 |5 c5 g  H  N' X          面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的  
7 Q5 G* Z; }7 \1 e. w8 x          辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使0 m! h% I4 h. A9 R; K& r) `+ v6 P
          CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸
* r/ Q# I  f# T( L. j          (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇) S1 Q& a1 U+ n3 P' z/ ?# J" m; w5 A
          途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(
5 c& M$ {/ ]- `- d          如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。" Y. D- L/ }6 n( j" r6 C6 m
  , E+ u: w1 s. i
                 由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子+ J1 f( j1 g" s1 t& T5 a' D
          特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激
9 x8 G7 X; N# [- H4 ~7 I          活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能 够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，0 j0 s5 b5 L6 J$ n1 o3 J# K+ C
         从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 & Z( p5 n! P4 G4 Z# o% P9 L
          ! m5 ^; G2 l' C7 I' u
                 此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺) Y. v8 k) b% U$ C
           激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养; Y6 [1 \. k8 o: l
           时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
/ \6 V, q, F. e5 }; y! G•   IL-2 (白细胞介素-2); p0 Q/ P0 k+ n( d9 X1 l% m( _
                 IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-
+ p( u1 ?( m4 S; J+ B. {           2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞  A& i7 E0 v) K' ]
           活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加+ p- m# |& f6 W/ S( h% q. ~
           IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。2 ]: @3 D6 A- E$ y
•   IFN-g(干扰素-g)
0 a2 Y9 ~  o. f                  IFN-g;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强
1 u9 h$ @$ `( @0 o           度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活2 P/ h4 s; i9 f' x) b- J; F
           性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
# O% d/ q# h8 ]•   IL-1-a (白细胞介素-1a) 　# f% C  ?% o2 ?2 Q' I2 j
                 IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显
1 T* e$ r+ V6 q% m0 ?* k7 {$ Z" y           提高CIK 的细胞毒作用。) y0 ]) w5 q3 H3 a; f8 Y) b5 |
  
6 k5 R1 e$ ~& C4 h) F【细胞制备】
6 j+ s+ W# Z& A  D5 X1 t+ s1． 外周血单个核细胞的采集& k% c% g& i  U( u
        1.1      用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
$ c) H- W7 P/ K; }5 W2 s; h/ N        1.2      淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
  Y, ^* L& f" X$ d4 W. x2 b        1.3      无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。! H7 _3 q/ G4 N
   ( I, G5 D8 t0 @( \) W% g
2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备
+ B/ `. f% V( u* z3 [                 用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-
" p' _% W9 O8 b# ~' w+ j         Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。5 [+ Q: i! h. G* H
  . G( A: ^7 p7 Z& `) u0 B+ A5 u2 q
                 用TSA或TAA负载的DC具有很好 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，) w3 ]1 b+ V! H9 L/ C
         而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆， 从而( B$ ?) ^  K8 V' x
         实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
2 W/ r4 `8 b5 [: ]8 E0 w4 q    6 @1 E0 M1 v8 e$ s
                 肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或
2 s" c( \, h8 q2 G: S         死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤 活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞
( {, u% @! k+ ^$ s4 i& R         裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
( n& e( K6 f/ G9 m- `  
' l) ^8 z8 O/ @2 G6 [# G% b: }                 反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
. X' u. Y) o: F2 y' |# R          2.1      手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
$ z1 |: r1 t/ L& d) ^          2.2      无菌生理盐水洗3次；
! }! J/ G& V1 G: P, p  f( w          2.3      用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
! S+ f: \3 ]( k: p+ f! `$ a          2.4      200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
& Q0 K6 O5 Y1 q) `& _0 B) e! V          2.5      用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；5 B+ X: f) x1 Z% [% i- t
          2.6      将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；! d( t+ Z6 n, D2 t: H  b
                   注：也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。: D( a0 Z) c6 c9 [, i0 }
          2.7      将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
4 v7 r5 Y  c9 r2 c# V7 K6 K          2.8      收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
8 |; G. W& l% g( w/ }+ N5 b          2.9      -80oC保存备用。7 \7 S" H! I6 p4 p3 }
2 V( s6 Z. o0 v! }9 B
3． CIK细胞的培养及鉴定1 m/ g  i$ }* G( M
          3.1      步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；0 y5 M, X0 `- |& Z
          3.2      37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;8 _% Q& d4 C9 _# w1 Q
          3.3      收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；+ e7 t5 g  q0 ~! ]
          3.4      加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；5 Q) c+ K6 c! b0 t
          3.5      24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；
4 q$ g' }& m8 x8 C                     注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。6 [& N7 d. }; w& C
          3.6      每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
/ P- \7 ?4 B, c2 V& f4 \5 i+ g          3.7      在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
9 T! t! a. B/ i9 V" ^* G% |          3.8      CIK细胞质控：1 d: ^1 x) [6 s  }
                   3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；: s" z1 O' K' t. I; a
                   3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明& ^1 j3 A9 j. |% E4 o* E
                              显提高。( _, W& T; @* e0 g$ O
  
: |* Q  H! \" }8 N" e' T0 s 4． DC 细胞的培养及鉴定+ M6 W8 y* P' _. \8 m" |
           4.1      步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人
! y/ z! h( ?% R% Q' u3 S$ o$ R# y/ Z                      IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
: A7 B0 g$ l3 j8 e           4.2      每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；( n8 X/ p$ q; Z  T" J
           4.3      (可选步骤) 在培养的第5d， 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；0 F* a: H6 K# e  [! A$ A; L3 ~) R
                      注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。
, l( A  {) D+ l+ e; L4 |; P0 I           4.4      在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；3 p3 _9 t$ c5 h) h% J, C3 H1 k
           4.5      在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
3 Q+ x# p' f, B7 f) R6 n3 J. V  K5 a           4.6      DC的质检：
6 r7 {" v- m% H) p; [( E                   4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
/ v4 [! |0 I, ^# v2 N3 k                   4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。/ p7 F  m% B6 ?8 d6 Q9 V# p' @' L
  % K) L( [3 d+ r- F9 T
5.     DC-CIK细胞的制备和质检( ~, x. j/ c+ M. c" z5 L
           5.1      收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添0 L; z8 Q) F+ p& |# X
                      加重组人IL-2 (300 U/ml)；
+ A2 s3 o+ ?7 I# c& u) `, d6 ]0 _           5.2      每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
# c; n6 t  h7 T# X! @           5.3      在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
3 G' Q1 I! M) q; l( E( U' Y7 i: J           5.4      DC-CIK细胞的质检：5 _" z& G3 w+ p- V* b# N" |
                    5.4.1      台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
5 _8 M8 N( m8 W                    5.4.2      流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%# B! V, j% h5 m( y1 i
                                   以上。
0 y5 r) v3 A* A1 t& N                    5.4.3      细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
0 r- B2 J; X1 r9 M0 M                                   细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 1040 ?+ ]6 ]% Y  M+ m" N9 a
                                   个，终体积 为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检) M$ o. {0 a. H9 q# y2 `4 l
                                   测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
" I$ o3 ?* J$ h# y( J7 R                    5.4.4      收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病
% w& F5 s/ [# c+ j1 _                                   原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
, |5 v  g; M2 W1 Z& t; g- ?0 a) |' {$ b
版主加注：不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。（四楼aidiulgy9517异议，尚需进一步确认，请大家跟帖讨论该问题） * P+ `9 t0 B; I/ @7 }
  【步骤简图】
6 O6 G; S! H" {6 g  z  [# h: T  n( K/ L# L/ E+ z4 c

yakunsong

学习了，非常感谢

mmssyyee

很详细。

aidiulgy9517

回复 defu 的帖子
4 a* C. C! W' z) R1 _7 u4 i. w) k* s5 Q
很好，谢谢！ 不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。

Life_Tech

支持，很好的内容。

刘艳85

想问一下，CD3用的是什么厂家啊？谢谢

细胞海洋

回复 aidiulgy9517 的帖子
2 P; E# [4 k! g) c9 ]
' Z# P* X, M: h8 }5 t! G你好 这个问题我不懂 因是会员发布帖子 尚需大家来共同确认是否存在错误。
. h0 P" [( e( m; k , l) ?; T  A- \" r3 ?) c
帖内已经红字加注，你能说明一下具体哪里有问题，如何修改？; S9 ?3 O# j1 ?- D6 D
% Z8 U" i" b" S4 V5 b9 |
谢谢你的支持

helong

DC的培养方法已经发展变化了，上述方法算是经典方法，但耗钱费力。# L) E: |  n% r  Y3 r* c; h$ I
CIK是非特异的方法，DC具有一定的特异性，DC-CIK联合则兼具特异与非特异，实际情况是不伦不类。/ L& x: h( ?; h2 ]) w
实际应用中，我相信CIK+DC方法优于DC-CIK！

aochongyu

很好的帖子，顶一下

helong

回复 细胞海洋 的帖子
7 F' J6 o0 T( f: n6 F5 `1 B6 Q) |4 \  @& N! f
看来斑竹也是大外行