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首先胎鼠日期的确定：头天下午五点左右合笼，第二天早上九点分笼此时间段即为0.5天。
9 k( D' A. j% v. l6 v( ^细胞分离过程如下：取得部位大致为cortex，脑膜及cortex表面的膜取得较为干净。基本上可排除红细胞的残留。6 t. H5 W$ V7 a* J$ m# w. Q8 f k* ], _
准备所需试剂：CMF-HBSS，Neurobasal，B27，10×Trypsin，100×DNase，200×TI2 K; Q" T# h6 t; d: j, g
准备E12.5~E14.5的胎鼠。（一般一只孕鼠，即可）% ?7 W6 @& c8 _- }5 f0 N( x. c
在解剖镜下分离E14.5胎鼠端脑（皮层），放置于含有预冷的CMF-HBSS的35 mm dish。
8 N" p/ l i7 j( d5 R! S在超净台中，小心将35 mm dish中的CMF-HBSS吸干，再加入2 mL的CMF-HBSS洗一次，最后用1 mL的枪将CMF-HBSS连同分离的端脑转移到15 mL离心管。! n% b2 h! E" V5 T+ }2 u
再用2 mL CMF-HBSS洗两次。
P1 ^8 _2 j j1 B' e2 r' D吸走最后一次洗的CMF-HBSS，再加入1 mL CMF-HBSS，之后加入等比例的10×Trypsin (1:10，0.1 mL)和100×DNase (1: 100, 10 μL)，37ºC水浴放置10分钟, 每隔2分钟摇一次。6 u! {4 `) P) e) N7 b$ P
加入按1:20比例加入1%TI（Trypsin inhibitor，Stock 1% in CMF-HBSS，50μL），混匀后800 rpm, 3分钟。1 S6 Z# }# U: `
弃上清，加入2 mL Neurobasal medium（NB）洗一次，800 rpm, 3分钟（重悬但不必吹散细胞）。. P0 r% ]" E4 Q
再弃上清，加入3 mL NPC culture medium (NB+2%B27+20 ng/mL EGF+20 ng/mL FGF)，用1 mL枪轻柔吹打混匀20次，静置2分钟后，转移上清到另一新的15 mL管中。静置2分钟，再转移到新15 mL管。取出10 μL加入到含有90 μL NB的EP管中，混匀后，计数（1:10）。
7 D) o9 u! I m- |$ @& O按1×106/ dish的密度种到60-mm dish或T25 flask中，第3天即可观察到明显的神经球形成。
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0 {$ i- R7 Z1 d! {& E+ C9 ]希望大家能晒出自己的protocol，相互借鉴。6 u. _& n" s* M8 W8 f
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发表于 2014-5-22 22:17
