求助！！急求神经球贴壁解决方案。

xiangxiaoliang

最近开始分离培养神经球遇到一些问题希望能得到大家的指点！如下我将详细叙述实验过程。
# O) X4 A# j* z, x我取的是E14.5天胎鼠端脑，以Neurobasal，2%B27，20ng/ml（FGF,bFGF）培养基，按10W个细胞/60mm dish 培养；约三天后可见神经球（此过程未见神经球贴壁）。接下来在传代，我是用Accutase消化后将细胞打撒成单个细胞，培养体系同前；第二天观察可见很多细胞团，第三天细胞团可生长至200um左右，但出现很多球贴壁（约2/3）。因为之前的dish为普通dish，我之后又用Poly-HEMA包被dish，具体包被是用无水乙醇溶解Poly-HEMA，工作浓度为20ug/ml；60mm dish我加入2ml，室温放干，用之前紫外照射30min，后用PBS洗涤3次。用poly-HEMA包被的板传代后神经球贴壁情况有所好转，但仍有约1/4作用神经球贴壁。我想请问怎么防止神经球贴壁？谢谢各位不吝赐教！！

mecol

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% N6 q8 x% Q* z( N" N: }: N! N$ d3 ]& h) q7 ]: Z
请问“按照10万/60mm dish培养”中，怎么控制细胞数量的啊？

碧螺春的秋天

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4 _) X9 v+ |8 a! v( ^* |9 V# ]4 G! X1 ~' N2 O9 @
六厘米盘中种10万个细胞

黄毛

我是养人的诱导神经干细胞的，根据我的经验，贴壁的细胞是所谓的杂细胞，我检测过贴壁的细胞神经干marker表达量比悬浮的神经球低。poly－HEMA也试过，但是容易包被不均匀，还是会有贴壁和形成神经球大小不均匀的情况发生。康宁有一种低粘附瓶子效果不错，可以试一下，但是价格有点小贵。

mecol

回复 碧螺春的秋天 的帖子; y% P  X2 t" b, `

7 x$ ]  S# S; V: l4 r0 b& Q2 U意思是长满了的话，不用计算就是十万个细胞吗？

xiangxiaoliang

谢谢，楼上兄弟参与讨论。我取的原代获得的细胞分离效果还是很好的，基本上成单个细胞，细胞计数培养就是。贴壁是发生在成球以后，贴壁的神经球形态与未贴壁的神经球无异。我觉得楼上兄弟说的“检测过贴壁的细胞神经干marker表达量比悬浮的神经球低”是不是与贴壁后神经球开始分化相关？看来大家都遇到类似的问题，哪位在解决神经球贴壁和成球大小不均一方面有好的经验？谢谢！

zb_ming

当初我养nsc的时候用的是dmem/f12再添加egf和bfgf，当然这 不是关键，关键是你要确定对细胞不能刺激太大，否则就铁壁分化了。一般情况下，穿戴后会有贴壁，但没你说的那么严重。我感觉你还是要摸索培养条件并进一步优化才行。你说的E14.5天的胎鼠，请问你是如何确定时间的？谢谢。另外，你的脑子是否剥离干净呢？成纤维细胞影响挺大的，其次是红细胞，一定要洗干净。你说你细胞计数了，那么你是怎么调整细胞浓度呢？并不是你的细胞刚刚好在你要接种的密度，这种概率很低的。欢迎讨论。

碧螺春的秋天

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& _4 [+ T+ \5 s- K6 O* z) w: O2 \' u" E* _% F. T( ^
做实验之前要先用计数板给细胞计数，然后算够十万个，种到板里

xiangxiaoliang

首先胎鼠日期的确定：头天下午五点左右合笼，第二天早上九点分笼此时间段即为0.5天。
! W: S% E' g# J( Y& p细胞分离过程如下：取得部位大致为cortex，脑膜及cortex表面的膜取得较为干净。基本上可排除红细胞的残留。! ~% s0 M/ |2 |! |1 G" W$ L' E5 w& d
准备所需试剂：CMF-HBSS，Neurobasal，B27，10×Trypsin，100×DNase，200×TI
$ O& E( y8 r5 m& w1 e8 s0 ~, b8 Y准备E12.5~E14.5的胎鼠。（一般一只孕鼠，即可）% X- A3 E$ z1 _6 o' z* j: l
在解剖镜下分离E14.5胎鼠端脑（皮层），放置于含有预冷的CMF-HBSS的35 mm dish。- E) `6 M- D6 c! r& C7 |' Q
在超净台中，小心将35 mm dish中的CMF-HBSS吸干，再加入2 mL的CMF-HBSS洗一次，最后用1 mL的枪将CMF-HBSS连同分离的端脑转移到15 mL离心管。
. E' c/ q( D* s  I  x! W; @再用2 mL CMF-HBSS洗两次。 5 v: X5 v0 X3 o
吸走最后一次洗的CMF-HBSS，再加入1 mL CMF-HBSS，之后加入等比例的10×Trypsin (1:10，0.1 mL)和100×DNase (1: 100, 10 μL)，37ºC水浴放置10分钟, 每隔2分钟摇一次。
6 A0 f: |6 P3 j* c加入按1:20比例加入1%TI（Trypsin inhibitor，Stock 1% in CMF-HBSS，50μL），混匀后800 rpm, 3分钟。1 Z* R- Z5 @/ M( U1 v/ s
弃上清，加入2 mL Neurobasal medium（NB）洗一次，800 rpm, 3分钟（重悬但不必吹散细胞）。$ _: ~1 r% [9 j
再弃上清，加入3 mL NPC culture medium (NB+2%B27+20 ng/mL EGF+20 ng/mL FGF)，用1 mL枪轻柔吹打混匀20次，静置2分钟后，转移上清到另一新的15 mL管中。静置2分钟，再转移到新15 mL管。取出10 μL加入到含有90 μL NB的EP管中，混匀后，计数（1:10）。
8 \' L- n3 S- i" S按1×106/ dish的密度种到60-mm dish或T25 flask中，第3天即可观察到明显的神经球形成。
/ p+ `1 G9 q! h% K* t) W6 S
, ?8 m' Z! _/ W5 x7 |希望大家能晒出自己的protocol，相互借鉴。
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xiangxiaoliang

关键是传代的第一天贴壁很少，之后逐渐增多。% R! Y( Y" o6 n2 u, f3 z* a