流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

1 h! Q4 m! X$ I# U
我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。
& W$ q9 G9 u6 i* O先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

回复 仰天 的帖子6 r' @) r! X  w* {

% V5 n+ P0 s, I/ U! B% v细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

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+ m1 S) M, Z+ B7 w/ b7 K8 T2 w6 o# H7 ~$ p* f9 c+ r& l, W2 n
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 " N% I8 r9 l! p) M) J
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
+ m  y: W- K: n(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
! f/ [9 b. l& l+ ^; Z(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
( f$ V. n1 P) |8 R(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
; g7 M4 |8 H9 g9 z8 l! x, d(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
5 t8 J. A* U; Z* V% m3 K3 m" \: u这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34 % \8 M& S7 O7 I
最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

+ m1 y4 |9 s. X
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 8 u% c& r- }9 L- ^( H5 q+ I: B$ Z
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
" l3 |8 y, A: T5 Y(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
7 o6 C+ f0 r6 {* I/ N(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。- r& Z4 c# L( B7 s2 r" F* W6 L
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。. n9 V- g2 R. x; [: U  y. b" U/ i
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。) S1 N  k0 M2 @7 }& X4 j5 {) ^

rocfield

回复 qing蓝qing 的帖子$ O" j/ _0 M) q( P

1 g" E% c# ^7 |. I  }4 z不知道您的这个流程是从哪里查到的？
2 C* L( K8 A& O$ v我们做的大致是这样的：. G$ I/ `4 |/ A
1：收集的细胞用PBS洗一次；
+ j5 e" j0 L/ B5 n" u" t2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；* _3 P4 f4 v  B1 a: G
3 PBS洗两次# F( O% _8 q! L, N* U7 R2 ]' O9 r5 n
4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）0 q" v- m0 j7 V6 d4 N6 q
如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

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- i1 O9 ~+ t9 F: e: k* f. j1 V4 }- u! l! z) G- R
谢谢指教

shaozi402

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$ p5 ]2 e7 Y) _1 a/ i) N# ~* b- ?8 q9 g
检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？