Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：
* \$ u9 z! T" I! P) M( c      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，# W' q8 W/ K. c$ d4 F
       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
  g  [; j- Z* }2 M% i( w/ {6 }/ I) _; Q& a  k; E& J
2、反应参数的确定：
7 s: Z" x* `9 ?& y       一般为：94 ℃，10-20S0 t8 x' M# z/ ?& m! S
                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度1 K1 H/ N- W, T/ t3 ~+ z5 {  ]
                     0 u: f- P' v! b5 t5 h8 I
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
, d1 k; {6 t3 D% ^. E: v( T       引物浓度：50-900nM
; }' `1 a% P( e% _7 ^2 U: p       探针浓度：50-250nM, u" C9 x' T" v0 L

Tlexander

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