Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：( j' r/ t9 w! n
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，, F  _3 g. g% J4 Y+ F
       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
+ u9 t0 J' G8 z1 Y/ R; X
2 e* q4 h0 B5 w) y( f1 d2、反应参数的确定：
/ f) c- g- @" _! m4 @- h0 {; S       一般为：94 ℃，10-20S
" {# l, R5 M4 r8 P- D6 k                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度! Z0 J& ~3 c% Z% b1 Q( {
                     
, t* l& L9 r* z( ^1 u3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值. c/ {# A: g6 u5 U* a
       引物浓度：50-900nM
1 \, j; |* c4 u& c       探针浓度：50-250nM0 j  ^; C9 O! k% k

Tlexander

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