Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：" r; _( n4 F& `7 G1 L% ]
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
2 E- o5 r4 j- w) `+ _! D, j       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ # e' ^' S# Q% a. `, y5 Z% J$ s
& N* F7 B" K. |
2、反应参数的确定：
8 L. S5 S1 d+ D9 |$ [3 `$ g) X       一般为：94 ℃，10-20S
4 t1 B1 z8 t2 x) t( `- |1 m0 N                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
& `+ A; d6 K; p) ~# A                     5 y- @+ _6 \+ f# ?' T3 U
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值* b' B. R  h. S) C% @
       引物浓度：50-900nM
1 e8 q/ y# q4 G/ C, n: i: P, |8 a       探针浓度：50-250nM
- T4 i2 D( G1 O, v4 X

Tlexander

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