Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：
6 J$ k- t1 d5 G& o0 j; p      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
# f% a$ b2 Q( V  l' W       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ 9 A! S6 v: @: g3 }

7 j9 M+ J  j: u4 `2、反应参数的确定：# e: u) z8 h1 J% [5 h' \( _3 ~
       一般为：94 ℃，10-20S
$ _5 ?7 n. F. b5 g6 M# S% y                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度5 A9 O" T; h. s& R5 O
                     0 V, J, A+ D1 Q- I  x) a6 l+ a
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
& z- K3 X' G( |       引物浓度：50-900nM
$ X! M6 ^5 i2 n: ^! r4 k       探针浓度：50-250nM
6 L5 |. l8 N* t% U

Tlexander

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