Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：& D+ _4 K/ O) |7 s/ Q1 R: ]
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
+ K5 l0 ~1 r+ ^8 ?* z/ c       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ 9 f: _' K' C8 S

6 c( z1 h5 T# S# C  n1 \2、反应参数的确定：
! Q; [, O+ \( W( _6 C       一般为：94 ℃，10-20S
1 k, A) v) z0 C7 F                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度& V0 A5 t0 N0 N; ?, y
                     9 O: U- V% d( ?! ?1 E" ]
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
7 x& ^/ ]1 M6 [. G! [/ B) Q& P1 ]       引物浓度：50-900nM
  s9 ^- J. ?5 [- q8 U; H1 W       探针浓度：50-250nM# k' P  {' B, M$ u

Tlexander

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