Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：
  s& N$ a) J3 e      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
% x5 f. o3 N, u1 H       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ : H9 n3 b, D$ p/ r. B

5 t! m. K! J1 Q: z) u( B2 i+ A2、反应参数的确定：
7 a1 ?1 ]1 g# v& [       一般为：94 ℃，10-20S
3 s- t6 u: y. n3 z2 }" E4 C( Q                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
" H% k! i2 q7 t$ O# S4 A                     
2 k/ A& F) T$ r& X& p3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值" y. u+ y$ a  Y4 A/ G
       引物浓度：50-900nM! @+ K( i; x' f
       探针浓度：50-250nM& @1 F8 _# C$ V: b

Tlexander

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8 u0 X2 k. O4 C# ~: r, R
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