Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：4 U3 L3 P8 O& }2 p  z: w
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，, G# P: T+ @, J- h
       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
3 C% `: w8 x- q$ o. H: @& J& n: y5 G' }! E
2、反应参数的确定：- ^' x% {; O4 l1 u. s6 o" g: N7 [
       一般为：94 ℃，10-20S
+ }6 E+ |% x1 p  x+ V- A& e( Q                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
2 n& |; n4 x3 \                     
) U3 d7 ?- Z" _4 `3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
7 i" P, h3 F4 H/ U       引物浓度：50-900nM' D  A6 y2 s* b
       探针浓度：50-250nM4 G" R. \; i5 y0 s