|
- 积分
- 224
- 威望
- 224
- 包包
- 797
|
首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
7 |& D3 G/ m( b. x% Z/ K大致培养过程：
6 q7 C, W4 f+ b" ?) P2 fD0
3 c+ F; Z! a: U4 q+ i用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
% m$ Z2 {8 I3 M6 L( t培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。' I) l3 ]0 P6 b( w4 d! B, R' O" K
D3/ B) e/ `0 g2 K# r% M9 e+ \
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
' z$ s) w" z$ E3 ]# T/ ID6-D176 I/ u L" t0 ?% o
每隔两天计数并调整密度为200万/ml
, G1 T, s, A7 H% ?D17' t9 D) g* j; a
收集细胞并表型检测。% N* z1 C4 B+ s, v& F
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
# f) D8 z3 ~! h1 z! G& P4 w: u0 j4 v2 b; m' u, i8 c' S
另外再分享一下开发NK工艺的经验
2 j3 Y+ e3 S4 s1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
' H( s9 n5 W; j+ l+ S" U4 _/ ?: v) R2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。5 I h7 R$ _' N9 C4 U1 |
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
5 O/ [; ~2 s4 @8 ^: X8 G* X) m0 A9 c1 s- T2 r: G- x- f
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。: N' \7 u# t3 K2 ?
另外对NK培养提几点经验：7 s& Q) u9 C. F$ w
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。; T% W/ d; F# p& T
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
3 q) q7 p, C# _" A. M! P& H/ O. s3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
6 L5 ?1 S/ Z# K" H4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
-
总评分: 威望 + 34
包包 + 60
查看全部评分
|
发表于 2015-4-29 22:16
