个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。) g9 A. B9 ]1 Y4 `+ _
大致培养过程：
" c( |+ l  s& v' B/ p: WD0) ?8 S; x; c/ A, A) s4 [: E) A" d* Z
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
% f# ~$ D$ h8 E) Z培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。0 Q0 F1 q- n; u( h+ H) p0 v
D3+ g0 e$ G3 E" [5 _3 A
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
' f! [" M9 H1 y6 }D6-D17( S) m! p* {; C' t  Z
每隔两天计数并调整密度为200万/ml
; {' _; \$ N3 {  g7 HD17
8 I1 G, K4 ]& |" H收集细胞并表型检测。
8 C# Z' w/ H3 X1 F9 c1 l' ]6 @此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
8 ^& Q, `: b4 V8 x  s9 \& f: A6 B1 P" |) X1 i
另外再分享一下开发NK工艺的经验
3 E2 ^1 H2 n. y1 R1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。+ d; {  s% ?! {4 e$ `# b: F" d
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。, I+ i8 F2 a' a. S" r+ J
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
- O# Y; \: e' l7 @3 R
, `, J) k; l& `, N8 E以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。' ~$ s8 k0 g0 X- F# r7 a  P! H+ t
另外对NK培养提几点经验：
0 O* t+ L- `9 {1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。+ M% t  B) j3 m" G& P" b9 D; N/ \
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好. h5 d: x- E& i' o: |6 @% y+ U
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
0 _6 G4 x/ B1 @4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

回复 chenlin080102 的帖子
- C; q8 h. L, K3 ?' b' O8 g$ Y* a
楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

回复 暖羊羊 的帖子  ?: r" k0 C- e5 v+ a2 S
" i/ l# F  m$ r0 }. @5 o" W) p
可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子6 t4 p  ^  A0 a& ~

3 D; r- l+ ]/ `- P尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

回复 lunyuyuanxj 的帖子
' d' \/ X# A7 f/ p; `
1 l/ c2 M6 j. f  b这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了