Touchdown and SD PCR

已有 446 次阅读 2009-11-27 00:37 |个人分类:生物|关键词:PCR

TD以及SD的PCR程序设定
1.  TD的基本操作:根据对引物TM值的计算,确定一个退火温度的大范围(不是一个点而是可以跨越10-20度的温度范围),计算的TM值应该落在这个范围内,让退火温度从选定范围的最高温度开始,逐渐降低温度,每次降低一度,最后结束在选定范围的最低温度,在每一个停留温度上循环两次.SD中,退火温度每次变化幅度更大,而每一部中循环次数较多,这就是得程序设定简单了一些,如果程序可以由5-6步组成,每个温度上有5-6个循环,每一步得温差3-5度.
2.  TD得程序设计:
(1)  在94度始变性5分钟,然后进入下列主循环
(2)  94度,1min,复姓,2min,引物延伸Xmin(更具1000bp/min速率计算),如引物TM值为50度,则可以设定上限温度是55度,下限是41度,第一个循环得复姓温度从55度开始,以后每次递减1度,直到41度结束,共有15个变化温度,在每个温度上循环供2个周期,共有30个周期.
(3)  上述循环完成后,再次接10个循环周期,将复姓温度固定在40度,其余条件不变.
(4)  最后74度延伸7分钟,进入4度.
3.  SD程序
(1)  第一个循环得复姓温度从确定得温度范围得上限开始,以后每次递减3度
(2)  共经过5次温度变化达到下限,共跨越15度
(3)  每个温度上循环6个周期,共30个周期
4.  XDPCR
(1)  最长PCR得模板一定要保证全长.
(2)  取新鲜得细胞,如果不立即使用,可以加入5%(V/V)得DMSO,冻存备用.试验时候取用3*10 Devil

个细胞,用PBS或是其他平衡溶液洗涤一次,再次重悬与0.6ml,10mmol/l tris-hcl(含有0.4mol/lNACL以及2mmol/l EDTA)得缓冲液
(3)  加入40ul,10%SDs,100ul蛋白酶K(2mg/ml),7.5ulRnase A,使用手工颠倒方式摇匀,避免用振荡器剧烈振荡.
(4)  在50度水域摇床孵育1h或是过夜,消化蛋白质,为了获得高质量DNA,消化完全很重要得.
(5)  加入0.2ml饱和氯化钠,手工摇匀,离心,10000r/min,15min,蛋白质即可被沉淀为一个白色而结识得沉淀快,如沉淀快不紧实可以再次离心,如果蛋白质去除不完全,很可能是蛋白酶K/SDS处理这一步没有达到效果,取上清至于另一个干净离心关
Devil

加入2个体积得乙醇,手工颠倒摇匀,再次离心14000r/min,15min沉淀,离心去除上清,用70%乙醇来飘洗,干燥5-10分钟.
(7) 浓度高于300ng/ml.会很粘稠而难以使用,有时要4度过夜才可以
Musical Note

  PCR扩增使用热启动得方法:
(9)  除去DNA酶之外得各种成分加入反映管中,加热到75-80度并保持在这一温度再次加入DNA聚合酶,然后进入周期
(10)  配置下层试剂40ul,,加入PCR管底部,取一支AMPLIWAX至于74-80度水域3-5min,使其融化,轻轻加入反映管
蒸馏水  14-15.2ul
3.3*缓冲液2  12.0  1*缓冲液
10mmol/dntp  8.0  800UMOL/L
25mmol/LMA(OAC)2  4.5-5.2  1.1-1.3MMOL/L
25引物  0.4-0.8  0.1-0.2
25引物  0.4-0.8  0.1-0.2
总体机  40ul

(4)  加入上层试剂60ul
蒸馏水  1.0-40.0
3.3*缓冲液2  18.0  1*缓冲液2
2U/ulrthDNA多聚酶  1.0  2U/反映
基因组DNA  1.0-40.0  达1ug/反应
25引物  0.4-0.8  0.1-0.2
总体机  60ul

(5)  94度,1min,此时上下层试剂混合,模板变性
Devil

94度变性,15S,68度退火并延伸12min,循环20个周期.
(7) 94度变性15S,68度退火并延伸12min,随后每个循环得延伸时间自动递增15S,再次循环17个周期
Musical Note

  72度10min,
(9)  模板高CG含量,可能需要95-96度得变性温度,但是变性时间不宜过长,以尽量减少对单股模板和DNA聚合酶
(10)  对DNTP要求比较高,保持PH7.0-7.5
(11)  镁离子浓度要求高,可以每次递增0.1mmol/l
(12)  对于100ul得反映体积来说,50-100ng得量,过量得DNA模板可能会使非特异产物增加
(13)  循环次数比较多30-40个
5.  高含量CG来需要对各种不同DNA聚合酶以及能消除稳定二级结构得各种有机容积进行比较和选择
(1)  反转PCR常用于CDNA克隆以及基因突变
(2)  反应体系:5ULDNA模板(20-50ng),10ul10*PCR扩增缓冲液,8ulMGSO4(100mmol/l)2ulDNTP(各个10mmol/l),引物各加入4ul(50pmol/ul)10ul甲氨,56ul无菌水,1ulDNA酶总体机100ul
(3)  30个周期比较合适
(4)  循环:95度变性3min,此不为使变性.
(5)  94度变性30S,X度退火1min,72度延伸Ymin(具体酶分钟1000建基)
Devil

中止延伸72度,10min